І Н С Т Р У К Ц І Я

для медичного застосування

АЛКОТЕСТ

НАБІР РЕАКТИВІВ

ПРИЗНАЧЕННЯ

Набір використовується для кількісного аналізу етанолу в біологічних рідинах (цільній крові, плазмі, сироватці, слині та сечі) і призначений для використання в клініко-діагностичній та науково-дослідній практиці, а також судмедекспертизі в якості засобу первинного скринінгу проб.

Набір придатний для визначення етанолу в лікарських препаратах, харчових продуктах та бродильних середовищах.

Набір розраховано на 100 аналізів (при об'ємі проб 4 мл).

Набір зберігати при температурі від 0⁰С до +8⁰С.

ПРИНЦИП МЕТОДУ

Етанол при дії алкоголь оксидази окислюється киснем повітря до ацетальдегіду та перекису водню. Останній у с упряженій пер оксидазній реакції окислює хромоген до кольорового продукту, який визначається фотометрично:

алкоголь-

СН₃СН₂ОН + О₂       ^{оксидаза}   СН₃СНО + Н₂О₂

SН₂+ Н₂О₂      ^{пер оксидаза}           S + 2Н₂О

барвник

РЕАКТИВИ

1. " Хромоген". Суха суміш хромогену із складниками   фосфатного буферу (2,45 г).

2. " Ферменти". Стабілізована суспензія алкоголь оксидази і пер оксидази в сульфаті амонію.

3." Стандарт". Калібру вальний розчин етанолу,10 г/л (стабілізований).

4. " Осаджувач".40%-ий розчин три хлороцтової кислоти (10 мл).

Додатковий реактив: 0,8 М НСІ (концентровану соляну кислоту розводять в 15 разів водою: 10 мл кислоти + 140 мл води).

ДОПУСТИМІ ВЕЛИЧИНИ ВМІСТУ АЛКОГОЛЮ

В БІОЛОГІЧНИХ РІДИНАХ ЛЮДИНИ

Сироватка, плазма та цільна кров - до 0,25 г/л (порогова норма).

Перевищення величини 1 г/л приймається як юридичний доказ алкогольного сп'яніння.

Відтворювальність (коефіцієнт   варіації) – (5-7)% (залежно від діапазону концентрацій).

Лінійність калібрувальної кривої - до концентрації алкоголю 4,5 г/л у вихідній пробі (до 45 мкг спирту в фотометрованому розчині), що відповідає оптичній густині до 1,0 - 1,3.

ПРИГОТУВАННЯ РОБОЧОГО РЕАГЕНТУ

1. " Хромоген". Вміст флакону 1 помістити в термостійкий стакан або колбу на 0,5 л, додати 350 мл дистильованої води і нагріти суміш до повного розчинення. Перед використанням розчин охолодити до кімнатної температури.

Зберігати розчин у герметично закритій посудині при температурі від +8⁰С до +20⁰С у затемненому місці до 2-х тижнів.

2. " Реагент". У день аналізу помістити збовтану суспензію ферментів із флакону 2 у приведений до кімнатної температури розчин хромогену і суміш добре розмішати.

Реагент використовують у день приготування.

П р и м і т к а: При проведенні меншого числа аналізів готують відповідну кількість реагенту, змішуючи розчин хромогену та збовтану суспензію ферментів у співвідношенні 700:1, а саме:

V_xp = 3,5·N (мл);        V_е = 0,5N/100 (мл);

де V_xp - об'єм розчину хромогену, мл;

  V_е   - об'єм суспензії ферментів, мл;

  0,5 - паспортний об'єм суспензії ферментів, мл;

  N - число аналізів (включаючи сліпу та калібрувальну проби).

3. " Стандарт". Розвести стандартний розчин етанолу в 10 разів водою (0,1 мл + 0,9 мл Н₂О).

Розчин використовують у день приготування як калібрант з концентрацією 1 г/л.

П р и м і т к а: Усі операції зі спиртом слід проводити дуже ретельно, запобігаючи випадковому попаданню його в реагенти.

4. " Осаджувач". Вміст флакону 4 (10 мл 40% ТХО) розвести в 10 разів водою (додати 90 мл Н₂О).

П р и м і т к а: " Осаджувач" є концентрованим розчином сильної кислоти, тому при роботі з ним необхідно дотримуватись відповідних правил техніки безпеки.

ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

Довжина хвилі - 450 нм (спекрофотометр або фотоколориметр).

Кювети 1 см.

Температура інкубації - кімнатна (близько 20⁰С).

Підготовка проб крові (сироватки чи плазми).

У невеликі скляні пробірки вносять по 0,1 мл проб щойно взятої крові (для дезинфекції використовують водний розчин ріванолу), додають до них по 0,9 мл розведеного (4%) розчину " осаджувача" і струшують. Проби витримують при кімнатній температурі 5 хв і центрифугують для осадження білків при 3000 об/хв протягом 10 хв. Для аналізу використовують над осадову рідину.

Аналогічно обробляють сліпу та калібрувальу проби.

Розчин	Дослідна проба	Калібрувальна проба	Сліпа проба
4%-ний осаджувач, мл	0,9	0,9	0,9
Кров (сироватка або плазма), мл	0,1	-	-
Калібру вальний розчин етанолу (1 г/л), мл	-	0,1	-
Вода, мл	-	-	0,1

Аналіз проводять серійно по 20-30 дослідних проб із постановкою в кожній серії калібрувальної та сліпої проб за такою схемою:

Розчин	Дослідна проба	Калібрувальна проба	Сліпа проба
Над осадова рідина (відповідна для кожної проби), мл	0,1	0,1	0,1
Робочий реагент, мл	3,5	3,5	3,5

Реакцію запускають додаванням робочого реагенту в точно фіксований час із інтервалом, наприклад, в 30 с між пробами.

Зупиняють реакцію через 20 хв додаванням до всіх проб по 0,5 мл 0,8 М НСІ у тій же часовій послідовності, яка витримувалась при внесенні робочого реагенту.

Проби фотометрують при 450 нм проти сліпої. Реакційна суміш перед додаванням кислоти має блакитне забарвлення, яке в кислому середовищі переходить у жовте.

Розрахунок концентрації алкоголю (в г/л або проміле ⁰/₀₀) у кожній серії проводять за своєю   калібрувальною   пробою згідно з формулою:

С = Е_д/Е_кл

де Е_д і Е_кл - оптичні густини дослідної та калібрувальної проб відповідно, виміряні проти сліпої проби.

ПРИМІТКИ. 1. Час інкубації можна змінювати (10-25 хв) але дотримання однакового часу для всіх проб є обов'язковим.

2. При визначенні алкоголю в сечі операцію осадження білків опускають і при аналізі використовують 0,02 мл сечі, а в калібрувальній пробі – 0,02 мл розчину етанолу з концентрацією 1 г/л.

Час інкубації - 10 хв. Формула розрахунку така ж, як приведена вище.

3. Для сироватки крові (але не цільної крові) допустимо проводити експрес-аналіз і без осадження білків. Для цього використовують 0,02 мл сироватки, а в калібрувальній пробі – 0,02 мл розчину етанолу з концентрацією 1 г/л. Час інкубації - 10 хв. Формула розрахунку не змінюється. Похибка при аналізі алкоголю дещо зростає, проте для експресного виявлення алкогольного сп'яніння (С>1 г/л) такий варіант допустимий.

4. При проведенні аналізу недопустима наявність в лабораторії парів метанолу, етанолу, інших спиртів і летких окислюючих та відновлюючих агентів.

5. При наявності в   лабораторії фотоелектроколориметра із зменшеним об'ємом фотометрованих проб (0,5 – 1,0 мл), наприклад, " Мефан-8001", можна пропорційно зменшити дозу реагентів на всіх етапах визначення.

6. Алкогольоксидаза специфічна як до етанолу, так і метанолу (причому останній окислюється в 10 разів ефективніше), тому в особливих випадках для виявлення метилового спирту слід провести газо-рідинну хроматографію.

Термін зберігання. 6 місяців.

Упаковка. По 4 флакона у коробці.

Виробник. Інститут біології клітини НАН України. Источник

Адреса. Україна, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.