Про затвердження методичних рекомендацій "Обстеження та районування території за ступенем впливу антропогенних чинників на стан об'єктів довкілля з використанням цитогенетичних методів"

1. Затвердити методичні рекомендації "Обстеження та районування території за ступенем впливу антропогенних чинників на стан об'єктів довкілля з використанням цитогенетичних методів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України довести цей наказ до відома керівників міністерств та інших центральних органів виконавчої влади, установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ МОЗ України

13.03.2007  № 116

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

"Обстеження та районування території за ступенем впливу антропогенних чинників на стан об'єктів довкілля з використанням цитогенетичних методів"

1. Загальні положення

1.1. У зв'язку з забрудненням навколишнього середовища речовинами, що мають мутагенні властивості (далі - мутагени), і впливом несприятливої екологічної ситуації на здоров'я населення назріла необхідність розроблення методичних рекомендацій, призначених для дослідження стану об'єктів довкілля за токсико-мутагенним фоном.

Методичні рекомендації призначені для лікарів, співробітників науково-дослідних установ, які займаються контролем забруднення довкілля, джерелами техногенної дії на навколишнє природне середовище, а також встановленням причинно-наслідкових зв'язків між станом здоров'я населення та впливом на нього факторів життєдіяльності людини.

1.2. Методичні рекомендації розроблені з метою реалізації положень постанов Кабінету Міністрів України від 30.03.98 N 391 "Про затвердження Положення про державну систему моніторингу довкілля", від 28.12.2000 N 1907 "Про моніторинг стану здоров'я населення, діяльності та ресурсного забезпечення закладів охорони здоров'я", від 22.02.2006 N 182 "Про затвердження Порядку проведення державного соціально-гігієнічного моніторингу" та наказів Міністерства охорони здоров'я України від 11.03.99 N 57 "Про реалізацію Цільової комплексної програми генетичного моніторингу", від 22.03.2006 N 144 "Про виконання постанови Кабінету Міністрів України від 22.03.2006 № 182" та інших нормативно-правових актів з питань моніторингу довкілля та стану здоров'я населення і рекомендують процедуру оцінки токсико-мутагенної активності об'єктів довкілля, за результатами якої можуть бути розроблені реабілітаційні заходи, спрямовані на поліпшення стану навколишнього середовища та здоров'я людини.

1.3. Методичні рекомендації є основою для складання програм спостережень, аналізу даних, характеристики екологічного стану природних і техногенних об'єктів довкілля за токсико-мутагенним фоном. Методи дослідження, запропоновані в методичних рекомендаціях, дозволяють за допомогою цитогенетичних методів біотестування швидко оцінити сумарну дію всієї сукупності забруднювачів біосфери, які впливають на стан довкілля і здоров'я людини, на науковій основі спрогнозувати очікувані зміни в екосистемах і соціумі та своєчасно прийняти управлінські рішення щодо покращення якості довкілля, здоров'я і генофонду нації. Крім того, можливо установити не тільки наслідки техногенезу, але й визначити ефективність заходів з екологізації технологій, які впроваджуються в промисловість та сільське господарство.

1.4. Впровадження методів, наведених в методичних рекомендаціях, в комплексний соціально-гігієнічний моніторинг України надасть можливість сформувати банк даних, необхідних для розробки екологічних карт за показниками, що характеризують загальну токсичність та мутагенність об'єктів навколишнього середовища. Наведені методи дозволяють вирішити проблеми екологічного нормування за цитогенетичними показниками біоіндикаторів, а також оцінити екологічний та генетичний ризики для біоти та людини. Аналіз результатів моніторингу стану довкілля надасть можливість на науковій основі здійснювати екологічне та соціальне управління і сприяти поступовому переходу до сталого розвитку окремих територій і держави в цілому.

1.5. У цих методичних рекомендаціях терміни і поняття вживаються у такому значенні:

Allium-тест - тест на кластогенність, у якому як матеріал використовується коренева меристема паростків ріпчастої цибулі Allium cepa L.

Аберація хромосом - зміни у структурі хромосом, викликані перекомбінацією різних ділянок однієї чи різних хромосом під впливом мутагенів.

Адаптація - сукупність особливостей організму (виду), що забезпечує можливість життя в конкретних умовах зовнішнього середовища.

Анафазні аберації - група хромосомних мутацій, пов'язаних з порушенням руху хромосом під час ділення клітин.

Біоіндикатори - група чи популяція особин одного виду, за станом або поведінкою яких визначають зміни у стані довкілля, а також про наявність та інтенсивність його забруднення.

Біоіндикація - оцінка стану довкілля за станом його біоти в природних умовах.

Екологічний ризик - вірогідність навмисних або випадкових, поступових та катастрофічних антропогенних змін існуючих природних об'єктів, факторів та екологічних ресурсів.

Забруднення екосистем - привнесення у середовище чи виникнення в ньому нових, як правило, не характерних для нього фізичних, хімічних, інформаційних чи біологічних агентів або перевищення у даний проміжок часу природного багаторічного рівня концентрації перерахованих агентів в середовищі.

Мікроядерний тест - метод визначення мутагенної активності факторів зовнішнього середовища, полягає у визначенні частоти інтерфазних клітин з мікроядрами.

Мітотичний індекс - кількість клітин, що знаходяться у фазі мітозу. Застосовується для оцінки мітотичної активності тканин, а також як з тестів при аналізі мутагенів.

Мутаген - фізичний, хімічний або біологічний фактор, який має здатність викликати спадкові зміни у структурі молекули ДНК.

Мутагенний фон - сукупність фізичних, хімічних та біологічних факторів природного чи антропогенного походження, сумарний вплив яких визначає рівень мутаційної мінливості організмів на даній території.

Мутагенність - здатність викликати мутації.

Пилок - сукупність пилкових клітин, що утворюються в мікроспорангіях.

Пилкове зерно - чоловічий гаметофіт насінної рослини, що розвивається з мікроспори.

Стерильність - нездатність або знижена здатність організму продукувати нормальні гамети.

Токсико-мутагенний фон визначають за токсичними і мутагенними проявами у клітинах біоіндикаторів, що виникають під впливом шкідливих факторів, присутніх у навколишньому середовищі.

Токсичність - здатність окремих факторів хімічної та біологічної природи чинити негативний вплив на різні організми.

Частота мутацій - кількісний показник інтенсивності мутаційного процесу.

Якість природного середовища - стан природних та трансформованих людиною екосистем, що зберігає їх здатність до постійного обміну речовин та енергії, а також відтворенню життя.

2. Принципова схема досліджень

2.1. Методи визначення рівнів токсико-мутагенної активності об'єктів навколишнього середовища (води, ґрунтів, атмосферного повітря, відходів) ґрунтуються на встановленні різниці між значеннями цитогенетичних показників (стерильність пилку індикаторних рослин, мітотичний індекс та частота аберантних хромосом в кореневій меристемі, частота клітин з мікроядрами в епітеліоцитах ротової порожнини дітей дошкільного віку), у біоіндикаторів, що аналізуються (дослід), та аналогічними показниками в екологічно чистих умовах, або на воді чи ґрунті, які не містять токсичних і мутагенних речових (контроль).

2.2. Критерієм токсичності є відсоток зниження показників росту біоіндикаторів та величини мітотичного індексу в меристематичних клітинах у дослідах порівняно з контролем за 48 годин у Allium cepa L, 72 години у Rapanus sativus L. і 120 годин у Triticum durum L.

2.3. Критерієм мутагенності є збільшення частоти зустрічальності стерильних клітин пилку і клітин з аберантними хромосомами в кореневій меристемі індикаторних рослин, а також клітин з мікроядрами серед епітеліоцитів ротової порожнини у дітей дошкільного віку.

2.4. В методичних рекомендаціях пропонується структурна схема комплексного соціально-гігієнічного моніторингу довкілля, яка дозволяє оцінити стан природних об'єктів за токсико-мутагенним фоном, що є необхідним для визначення рівня загальної екологічної та генетичної небезпеки для людини та біоти (рис. 1).

Як видно із схеми, верхній структурний рівень показника включає три показника екологічного стану окремих об'єктів навколишнього середовища (атмосфери, гідросфери та педосфери) за токсико-мутагенним фоном.

Стан атмосферного повітря і території в цілому визначають за тестами: "Стерильність пилку рослин", "Мікроядерний тест" в соматичних клітинах дітей дошкільного віку, які мешкають на території дослідження, та "Ростовий фіто-тест".

Стан гідросфери та педосфери (ґрунтів) визначають за Allium-тестом та "Ростовим тестом".

2.5. Показники, що характеризують стан навколишнього середовища за токсико-мутагенним фоном, можуть бути застосовані для подальшого визначення загального екологічного та генетичного ризиків для людини та біоти, встановити еколого-оптимальні нормативи якості довкілля та здоров'я населення, розробити шляхи досягнення цих нормативів, визначити пріоритети при прийнятті вірних управлінських рішень.

------------------------------------------------------------------

|     Екологічний стан довкілля за токсико-мутагенним фоном      |

------------------------------------------------------------------

         |                      |                    |  

           |                      |                    |

------------------------- -------------------- -------------------

|1.1. Токсико-мутагенний| |  1.2. Токсико-   | |  1.3. Токсико-  |

|фон атмосфери          | |  мутагенний      | |  мутагенний     |

|і території в цілому   | |  фон гідросфери  | |  фон педосфери  |

------------------------- -------------------- -------------------

         |                      |                    |  

           |                      |                    |

------------------------- -------------------- -------------------

|Біотести:              | |Біотести:         | |Біотести:        |

|2.1. Стерильність      | |2.4. Мітотичний   | |2.7. Мітотичний  |

|клітин пилку           | |індекс та частота | |індекс та частота|

|рослин-індикаторів     | |аберантних        | |аберантних       |

|2.2. Частота клітин    | |хромосом в        | |хромосом в       |

|з мікроядрами          | |клітинах          | |клітинах         |

|в тканинах рослин,     | |гідробіонтів та   | |індикаторів      |

|тварин, людини         | |інших індикаторів | |2.8. Ростовий    |

|(дітей дошкільного     | |2.5. Частота      | |фіто-тест        |

|віку)                  | |клітин з          | |на зразках       |

|2.3. Ростовий          | |мікроядрами       | |ґрунтів          |

|фіто-тест              | |в тканинах        | -------------------

------------------------- |гідробіонтів      |

                         |2.6. Ростовий     |

                         |фіто-тест         |

                         |на зразках водних |

                         |джерел            |

                         --------------------

Рис. 1. Структурна схема соціально-гігієнічного моніторингу об'єктів довкілля

3. Методи токсико-мутагенних досліджень стану об'єктів довкілля

3.1. Вибір тест-полігонів

Для проведення соціально-гігієнічного моніторингу довкілля на досліджуваній території повинні бути виділені тест-полігони. Тест-полігони вибираються таким чином, щоб в першу чергу були досліджені найбільш небезпечні та надзвичайно техногенно навантажені райони. Відбір проб проводять як в промислових зонах, так і в житлових масивах, віддалених від підприємств.

3.1.1. Загальні вимоги до відбору проб грунтів

Відбір проб здійснюється згідно ГОСТ 17.4.3.01-83 Охорона природи. хрунти. Загальні вимоги до відбору проб, та 28168-89 ґрунти. Такі методи відбору проб ґрунту застосовуються при агрохімічному обстеженні, загальному та локальному забрудненнях, навколо підприємств-забруднювачів, поблизу автомобільних трас тощо.

При загальному забрудненні ґрунтів ділянки для відбору зразків ґрунту вибирають у відповідності з координатною сіткою, указуючи номер і координати.

При локальному забрудненні ґрунтів для визначення пробних ділянок використовують систему концентричних кіл, розташованих на диференційованих відстанях від джерела забруднення, указуючи номера кіл і азимут місця відбору зразків.

При дослідженні забруднень ґрунтів проби відбирають пошарово з глибини 0-5; 0-20; 21-40; 41-60 см, в залежності від мети дослідження. Крім того, визначається необхідний розмір досліджуваної ділянки, кількість і вид проби.

Максимально допустимі розміри досліджуваних ділянок визначаються в залежності від економічних районів країни: в Поліссі - 8 га, Лісостеповій зоні - 25 га, в Степовій - 40 га. В середньому розмір ділянки в Україні дорівнює приблизно 25 га. Для визначення у ґрунтах хімічних речовин розмір ділянки для відбору зразків коливається від 1 до 5 га, де відбирають не менш однієї об'єднаної проби, маса якої не повинна бути менше 400 г.

3.1.2. Обстеження земель навколо підприємств-забруднювачів та поблизу автомобільних трас

Обстеження земель навколо підприємств-забруднювачів та поблизу автомобільних трас проводиться згідно Методики суцільного грунтово-агрохімічного моніторингу сільськогосподарських угідь України.

Навколо підприємств-забруднювачів обстеження земель проводиться за системою концентричних кіл, розташованих на відстані 0,5; 1; 1,5; 2,5; 5; 10 км від джерела забруднення з урахуванням пануючих вітрів.

В методиці відбору проб ґрунту з ділянок уздовж дорожніх смуг, розташованих поблизу автомобільних магістралей, враховується те, що газопиловий струмінь автотранспорту викидається в повітря не високо над ґрунтом, а відстань переносу викидних газів, в тому числі й аерозолів важких металів, сажі та інших речовин, не перевищує 100 м в напрямках дії пануючих вітрів.

Ділянки для відбору зразків довжиною 200-500 м розмічають на відстанях 0-10, 10-50 і 50-100 м від полотна дороги, враховуючи рельєф, ґрунтовий і рослинний покрив, гідрологічні умови місцевості. На кожній із них відбирають 20-25 індивідуальних зразків для отримання змішаного (середнього) зразка ґрунту.

3.1.3. Відбір ґрунтів для цитогенетичних досліджень

Відбір ґрунтів при проведенні цитогенетичних досліджень здійснюється згідно методичних рекомендацій "Еколого-генетичний контроль за застосуванням пестицидів-мутагенів".

На першому етапі комплексного моніторингу навколишнього природного середовища з застосуванням цитогенетичних методів оцінки рекомендується проводити крупномасштабні рекогносцирувальні дослідження. Вони повинні бути прив'язані до стаціонарних постів спостереження Держкомгідромету та санітарно-епідеміологічної служби, а також повинні включати найбільш екологічно небезпечні і чисті території (за рекомендаціями Обласних управлінь Мінприроди України та санітарно-епідеміологічної служби).

В подальшому проводиться перехід до середньо- та маломасштабних досліджень щодо оцінки стану ґрунтів та інших об'єктів навколишнього середовища за сумарним токсико-мутагенним фоном. Такі дослідження, як правило, завершуються картографуванням території за даною ознакою.

Крупномасштабне картографування дозволяє встановити орієнтовані рівні мутагенного фону, а середньо- та маломасштабне картографування - диференціювати райони усередині окремих регіонів за ступенем мутагенного впливу та виявити джерела мутагенного впливу на одиницю площі. При крупномасштабному картографуванні за одиницю площі рекомендується ділянка розміром 10 000 кв. км. При середньо- та мало-масштабному - 1 000 і 100 кв. км, відповідно. На кожній одиниці площі повинно бути не менш 10 пунктів спостереження.

У випадку характеристики впливу окремих джерел забруднень (підприємств, електростанцій та ін.) на об'єкти навколишнього середовища рекомендовано застосовувати метод концентричних кіл через кожні 500 м до 2,5 км.

При оцінці екологічного стану міста з населенням 1 млн. чоловік рекомендовано поділити його територію на 20 квадратів з виділенням у кожному від 10 до 20 пунктів спостережень в залежності від рівня екологічної напруженості. В кожному пункті проба відбирається за правилом "конверта". Сторона конверта може складати 10-100 м. Об'єднана проба ґрунту формується із 9-12 проб, вміщується у відповідну тару, складається у ящик, ставиться печатка та наклеюється етикетка. На відібрані зразки складається супровідна відомість за формою, наведеною у додатку 1.

Періодичність обстеження ґрунтів встановлюється диференційовано з урахуванням особливостей території в середньому через кожні 5 років. Вказаний строк може бути збільшений, якщо різниця між показниками за циклами обстеження неістотна.

3.1.4. Відбір проб з водних джерел

Зразки з водних джерел (річки, озера тощо) відбираються на відстані 3-5 м від берега в чисті скляні пляшки і зберігаються у холодильнику до проведення дослідів. Якщо проби відбирають зі свердловин, то зразок води беруть у пляшки після 1-2-хвилинного зливу води. На зразках водних проб пророщують біоіндикаторні рослини і проводять цитогенетичні дослідження.

3.1.5. Відбір проб пилку рослин

Відбір пилку кожного досліджуваного виду рослин проводиться одночасно в усіх точках спостереження. З кожної моніторингової точки у суху погоду збирають добре розвинуті, готові до розкриття бутони квітів від 30 рослин кожного виду, досліджують від 1 000 до 3 000 клітин пилку з визначенням кількості стерильних та фертильних клітин. У деревинних та чагарникових рослин відбирають біопроби із неушкоджених, здорових паростків середнього ярусу крони південної орієнтації, а у трав - з екземплярів, зростаючих у територіальному центрі мікропопуляції індикаторів. Рослини повинні бути добре розвинуті і не мати ознак пригноблення. Бутони фіксують у момент збору у 70% етанолі.

3.1.6. Відбір зразків клітин слизової оболонки ротової порожнини людини

Кожна серія досліджень повинна включати групу дітей в кількості від 25 до 60 чоловік із приблизно однаковим співвідношенням статі. У групу для обстеження повинні входити здорові та практично здорові діти 5-7-літнього віку, які відбираються за спеціальним анкетуванням (додаток 2). Мазки слизової оболонки ротової порожнини беруть з внутрішньої сторони правої і лівої щоки і нижньої губи за допомогою стерильного ватяного тампона на індивідуальній скіпі з послідуючим нанесенням їх на предметне скло. Фіксують мазки в суміші спирту 70% й оцтової кислоти 3:1 або у 96%-ному етанолі. Термін фіксації складає 1 годину. Потім мазки підсушують на повітрі до того моменту, поки не зникає блиск вологи. У такому стані препарати зберігаються до фарбування.

3.2. Оцінка мутагенності території за мікроядерним тестом

3.2.1. Для оцінки мутагенності території використовується тест "Частота епітеліоцитів з мікроядрами в слизовій оболонці ротової порожнини дітей дошкільного віку" (далі - МЯ-тест).

3.2.2. Чисельність клітин з мікроядрами характеризує ступінь забруднення навколишнього середовища мутагенами, тому що мікроядра утворюються як результат патологічного мітозу.

3.2.3. Для оцінки екологічної ситуації за загальним мутагенним фоном використовують результати цитогенетичного обстеження дітей дошкільного віку, тому що вони є найбільш чутливими до несприятливого впливу зовнішніх факторів.

    3.2.4. Для     аналізу    частоти    зустрічаємості    клітин

з мікроядрами відбирають мазки епітеліоцитів з  слизової  оболонки

ротової порожнини   та   проводять  первинну  фіксацію  у  етанолі

96 град.  У  лабораторних  умовах  досліджувані   мазки   фіксують

в ацетоалкоголі  за Карнуа протягом 1 години та фарбують реактивом

Шиффа за Фьольгеном. Для приготування реактиву Шиффу 1 г основного

фуксину  для фуксиносірчистої кислоти розчиняють в 200 мл киплячої

води, остуджують до 50 град.  C та додають  20  мл  1  н.  соляної

кислоти, остуджують   до  25  град.  C,  та  додають  1  г  сухого

метабісульфіту натрію (Na S O ) та виливають у  герметичну  колбу.

                        2 2 5

Через добу рідина знебарвлюється та має слабо-жовтий колір.

Фарбування за Фьольгеном передбачає попередній гарячий гідроліз біооб'єктів він HCl з температурою 60 град. C протягом 6-8 хвилин та фарбування реактивом Шиффа 0,5-1,5 ч. Після забарвлення мазки проводять через три порції сірчаних вод по 5-10 хвилин у кожній, промивають у проточній воді та підсушують.

3.2.5. Мазки аналізують за допомогою біологічного мікроскопу при збільшенні 7 х 60. При визначенні частоти зустрічальності клітин з мікроядрами враховують їхню кількість і відносять до загального числа переглянутих клітин. У кожному варіанті аналізують не менше 1 000 клітин.

3.2.6. Мікроядерний індекс розраховують за частотою зустрічання клітин з мікроядрами за формулою:

                                 n

                           МЯ = ----                          (1)

                                 m

де n - число клітин з мікроядрами;

m - загальна кількість досліджених клітин.

Потім обчислюють показник абсолютного розкиду даних, виходячи з величини відносної помилки, яку визначають за формулою:

                                ---------------

                                | 2 x (n - m)

                                |-------------,               (2)

                   А = 1,385 x \|   n x m

де А - відносна помилка; 1,385 - коефіцієнт при чисельності вимірів більше 100.

Абсолютний розкид даних визначають за формулою:

                          а = А x МЯ,                         (3)

Таким чином, кінцевий результат мікроядерного тестування має вигляд МЯ +- а.

3.3. Оцінка токсичності або потенційної мутагенності атмосферного повітря за тестом "Стерильність пилку рослин фітоіндикаторів"

3.3.1. Для визначення загальної токсичності (або потенційної мутагенності) повітряного басейну застосовується тест "Стерильність пилку рослин-фітоіндикаторів", що зростають на досліджуваних територіях. В якості індикаторів рекомендується застосовувати види рослин згідно додатка 3.

3.3.2. Встановлено, що фертильні і стерильні клітини пилку рослин відрізняються за вмістом крохмалю. Нормальний його вміст відповідає стадії завершення формування сперміїв. Фертильні пилкові зерна цілком заповнені крохмалем, а стерильні - не містять його чи мають його сліди. Забарвлення препаратів проводять за Грамом. Для приготування йодного розчину за Грамом необхідно 2 г йодистого калію розчинити в 5 мл дистильованої води при нагріванні, з наступним додаванням 1 г металевого йоду. Обсяг готового до використання розчину доводять до 300 мл і зберігають у темному посуді.

3.3.3. Фертильні пилкові зерна офарблюються у вохристо-коричневі кольори різної щільності, а стерильні - або майже зовсім не офарблюються, або офарблюються фрагментарно на 20-30%, здобуваючи слабкий, майже прозорий жовтий тон.

3.3.4. Зрілі бутони квіток змішаної проби після фіксації у 70 град. етанолі (або без неї) препарують на предметному склі. Тичинки відокремлюються від всіх елементів квітки за допомогою пінцету і препарувальної голки і переносять у краплю йодного розчину. Пильовики дрібних квітів розкривають препарувальною голкою на предметному склі в краплі йодного розчину і, видаливши зайві тканини, накривають покривним склом. При необхідності додають ще 1-2 краплі йодного розчину. Через 2-3 хвилини приготовлений препарат піддають мікроскопуванню.

3.3.5. У кожному препараті переглядають від 1 000 до 3 000 пилкових зерен. Підрахунок стерильних і фертильних пилкових зерен проводиться під мікроскопом (збільшення 7 х 20 чи 7 х 40) із застосуванням лічильника.

Стерильність пилкових зерен визначається у відсотках за формулою:

                             G

                       М = ---- x 100, %                      (4)

                             N

де М - рівень стерильності пилку, %;

G - кількість стерильних пилкових зерен;

N - кількість досліджених пилкових зерен.

Потім обчислюється помилка підрахунку:

                          ------------------

                          |  M x (100 - M)

                          | ---------------, %                (5)

                  m = +- \|       N

при цьому повинна виконуватись умова 3 x m < М, у протилежному випадку необхідно збільшувати кількість спостережень, для того щоб зменшити помилку.

3.3.6. Оскільки індикаторні види рослин характеризуються різними рівнями спонтанної стерильності пилку, яка спостерігається у екологічно чистих - комфортних умовах (Пкомф.) і різними рівнями ушкодження гамет в критичних умовах (Пкрит.), була проведена класифікація індикаторів за п'ятьма класами: 1 - високостійкі; 2 - стійкі; 3 - середньостійкі (чутливі); 4 - чутливі та 5 - високочутливі. Характеристика цих класів необхідна для визначення умовних показників ушкодженості клітин пилку або індикаторних рослин за цитогенетичним статусом і подальшої інтегральної оцінки стану навколишнього середовища (додаток 4).

3.4. Оцінка токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел

Для визначення токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел застосовують такі високочутливі цитогенетичні тести, як "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в клітинах кореневої меристеми фітоіндикаторів, а також "Ростовий тест" на паростках різних культур.

3.4.1. Оцінка токсичності ґрунтів та водних джерел за допомогою "Ростового тесту"

Метод використовують для визначення токсичності різних субстратів: ґрунтів, водних джерел, мулу, відходів та ін. Цей тест можна проводити в різних варіантах:

- пророщування насіння рослин на досліджуваних зразках субстратів;

- полив рослин досліджуваними рідинами при вирощуванні у пісковій або ґрунтовій культурах;

- водна культура рослин на природних, питних, стічних водах, витяжках з ґрунтів, відходів тощо;

- рулонна культура - насіння індикаторів розкладають на вологий папір, який скручують у рулон та ставлять у ємність з досліджуваною рідиною.

У якості тест-культур можна використовувати різні рослини: Allium cepa Z, Rapanus sativus L., Triticum durum L. та ін.

При дослідженні токсичності ґрунту в кожну з експериментальних ємностей вносять по 100 г субстрату, зволоженого до 70% від повної вологоємності, і висаджують по 15-20 пророслих насінь тест-культури. Дослідження проводять не менше ніж у трьох повтореннях.

При дослідженні якості проб води і водних витяжок лабораторні склянки заповнюють досліджуваною рідиною 250-500 мл. Насіння індикаторної культури вирощують на спеціальних кільцях, обтягнутих марлею, які плавають на поверхні, по 15-20 насінь на кожнім кільці. Для цього випадку найбільш придатні культури з крупним насінням. Досліди проводять в умовах фітотрону, в якому регулюються світлові та температурні режими.

Через 2 тижні проводяться виміри довжини кореневої і стеблової системи, визначається волога та суха маса паростків.

Тестування зразків ґрунту та води можна також проводити в умовах термостату при t град. = 25 град. C, в чашках Петрі, на фільтрувальному папері, на якому розміщують 30-50 насінин тест-культури, які заливають 5-7 мл досліджуваної рідини. Якщо досліджують ґрунт, у чашках на папері розміщують 1 г здрібненого ґрунту та заливають 5-7 мл вистояної кип'яченої водопровідної води. Найбільш зручними культурами є рослини з дрібним насінням. Через 48-96 години проводяться виміри довжини кореневої і стеблової системи, визначається волога та сира маса паростків.

    По кожному з  досліджуваних  варіантів  обчислюється  середня

                                        _

довжина надземної  і  кореневої  систем  x  +-  m,  де m - помилка

середнього арифметичного, яка визначається за формулою:

                             ----------

                             |       2

                             |  сігма

                         m = | -------,                       (6)

                            \|    N

де N - кількість результатів,

         2

    сігма  - дисперсія, яка, у свою чергу, визначається

             за формулою:

                             N

                             S       _ 2

                        2   i=1 (x - x)

                   сігма  = --------------,                   (7)

                                  N

де S - знак суми.

Достовірність різниці середніх арифметичних (t) розраховується за критерієм Стьюдента-Фішера:

                              _    _

                              x  - x

                               1    2

                        t = ------------,                     (8)

                             -----------

                             |  2    2

                             | m  + m

                            \|  1    2

       _

    де x - середнє арифметичне значення показника в контролі;

        1

       _

    де x - середнє арифметичне значення показника у варіанті;

        2

    m - помилка середнього арифметичного в контролі;

     1

    m - те ж у варіанті.

     2

Фітотоксичний ефект визначається у відсотках щодо маси рослин, довжини кореневої або стеблової системи, кількості ушкоджених рослин або кількості сходів. Виходячи з кількості рослинної маси, що утворилася, фітотоксичний ефект розраховується за формулою:

                          М  - М

                           о    х

                     ФЕ = ------- x 100, %                    (9)

                             М

                              о

    де М  - маса рослин у ємності з контрольним ґрунтом (водою);

        о

    М - маса рослин у ємності з досліджуваним ґрунтом (водою).

     х

3.4.2. Оцінка токсико-мутагенного фону ґрунтів та водних джерел за допомогою тестів "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в клітинах кореневої меристеми індикаторів.

Для визначення токсичності та мутагенності ґрунтів широко застосовуються такі високочутливі цитогенетичні тести, як "Мітотичний індекс" та "Частота аберантних хромосом" в меристематичних клітинах фітоіндикаторів, серед яких найчастіше застосовують Allium cepa L.

На зразках ґрунту або водних джерел проводять пророщування насіння цибулі на фільтрувальному папері в чашках Петрі при температурі 25 град. C, в умовах термостату. В чашку Петрі на фільтрувальний папір насипають 1 грам висушеного та подрібненого ґрунту, який зволожують 5 мл дистильованої води та висаджують по 50 насінин індикаторної рослини. Через кожні шість годин проводять провітрювання. Дослід триває 72 години. В якості контролю використовується дистильована вода.

При появі первинних корінців довжиною 7-9 мм їх фіксують в ацетоалкоголі за Карнуа протягом 1 години, а потім переносять для зберігання у 70 град. етанол.

Фарбування препаратів проводять реактивом Шиффа за Фьольгеном (див. пункт 3.2.4). Цитологічні препарати готують з 1 мм кінчиків корінців (меристем), поміщених у краплю 45%-ної оцтової кислоти. Препарат накривають покривним склом, роздавлюють меристеми до отримання монослою клітин. Краї покривного скла заливають розплавленим парафіном. Приготовлений таким чином препарат використовують для мікроскопічного аналізу зі збільшенням 7 х 60.

На цитологічних препаратах ураховують усі фігури мітозу: профази, метафази, анафази, телофази, що зустрічаються серед 5-6 тисяч переглянутих меристематичних клітин.

Величину мітотичного індексу визначають як відношення кількості клітин, що діляться, до загальної кількості переглянутих меристематичних клітин та виражають у проміле:

                             m

                       МІ = --- x 1000, %                    (10)

                             n

де n - кількість досліджуваних клітин;

m - кількість клітин, що діляться.

Абсолютний розкид а визначається за формулою:

                      а = МІ x А, проміле                    (11)

де А - відносна помилка, яка визначається за формулою 2.

Зниження мітотичного індексу в порівнянні з контролем вважається результатом загальнотоксичної дії забруднювачів грунтів та водних джерел.

На цих же препаратах враховуються клітини з аберантними (патологічними) хромосомами. Частота зустрічальності патологічних фігур мітозу виражається у відсотках від клітин, що поділяються, а частота патологічних анафаз і телофаз - від переглянутих аналогічних фаз мітозу (не менш 200).

Загальну частоту аберантних хромосом визначають у відсотках за формулою:

                              G

                      А    = --- x 100, %                    (12)

                       хр.    m

де G - кількість аберантних клітин;

m - кількість клітин, що діляться.

Аберантність анафаз і телофаз визначають аналогічно:

                               G'

                      А     = --- x 100, %                   (13)

                       фаз.    m'

де G' - кількість аберантних ана-, телофаз;

m' - загальна кількість ана-, телофаз (не менш 200).

Помилка загальної кількості аберантних хромосом S визначається за формулою:

                         ---------------------

                         | А    x (100 - А   )

                         |  хр.           хр.

                    S =  |--------------------, %            (14)

                        \|         m

Аналогічно обчислюється помилка аберантності ана- та телофаз:

                         ----------------------

                         |А     x (100 - А    )

                         | фаз.           фаз.

                    S =  |--------------------, %            (15)

                        \|         m'

За зростанням кількості патологічних фігур мітозу у порівнянні з контролем судять про збільшення мутагенності ґрунтів або водних джерел.

3.4.3. Оцінка мутагенності водних джерел за "Мікроядерним тестом" в клітинах гідробіонтів

Для визначення ступеня хронічного мутагенного впливу забруднень водного середовища у натурних дослідженнях можливо застосовувати мікроядерний тест у клітинах різних тканин (клітинах крові, епітелію зябрової поверхні й ін.) організмів індикаторів.

Зручними об'єктами у цитогенетичному моніторингу екологічного стану прісноводних водойм є представники хребетних тварин: костисті риби - плотва (Rutilus rutilus L.), карась срібний (Carassius (aurata) gibilio Block), й амфібії - жаба озерна (Rana ridibunda Pall.), жаба ставкова (Rana esculenta L.), жаба гостромордна (Rana terrestris Andr.). Вони є кінцевою ланкою трофічного ланцюга водойм, акумулюють різні токсиканти у своєму організмі і постійно піддаються дії полютантів, розчинених у воді. Слід зазначити, що безхвості амфібії можуть служити для цілей моніторингу генетичних наслідків забруднення як водного, так і наземного середовища.

Відбір біопроб (мазків) здійснюється у весняно-літньо-осінній період. Мазки фіксуються в суміші Карнуа протягом однієї години, підсушуються і транспортуються в лабораторію (пункт 3.1.6). Фарбування мазків проводиться реактивом Шиффа за Фельгеном за пунктом 3.2.4.

4. Методика розрахунку умовних показників ушкодження стану навколишнього середовища за токсико-мутагенним фоном

4.1. У зв'язку з тим, що усі біоіндикаційні показники мають свої одиниці виміру, необхідно привести їх в єдину безрозмірну систему умовних показників ушкодженості (УПУ) біосистем. Це надасть можливість виконати інтегральну оцінку стану довкілля за токсико-мутагенним фоном і визначити рівні екологічної небезпеки для людини та біоти. Умовний показник ушкодженості біоіндикаторів визначають за формулою:

                             /П      - П     /

                               реал.    комф.

                    УПУ  =  ------------------,              (16)

                       і     /П      - П     /

                               крит.    комф.

    де УПУ - умовний показник ушкоджень біопараметру,

          і   спричинений дією різних факторів довкілля;

    П      і П      - експериментально (або експертно)

     комф.    крит.   встановлені значення біопараметра

                      в комфортних та критичних умовах

                      відповідно;

    П      - реальне значення біопараметра в досліджуваному

     реал.   варіанті.

    Абсолютна різниця  /П       -  П     /   дає   уявлення   про

                         крит.      комф.

амплітуду   зміни   чисельного   значення  параметра  під  впливом

шкідливих факторів навколишнього  середовища.  Визначаючи  реальне

значення  біопараметра  на  досліджуваній території (П ) та знаючи

                                                     і

величини П       і П     ,  можна оцінити ступінь зміни  параметра

         комф.     крит.

під впливом несприятливих факторів. Так, різниця /Пі - П     / дає

                                                       комф.

уяву про ступінь  порушення  біопараметра  під  впливом  шкідливих

факторів.

4.2. Оскільки стан об'єктів навколишнього середовища характеризується набором ознак, їх можна охарактеризувати інтегральним показником, ІУПУі, що обчислюються за формулою:

                                          -                  -

                                          |  П        П      |

                1     n          1     n  |/  реал. -  комф./|

       ІУПУ  = --- x  S  УПУі = --- x  S  |------------------|

           і    n    і=1         n    і=1 |  П        П      |

                                          |/  крит. -  комф./|

                                          -                  -

де S - знак суми;

    ІУПУ  - один з інтегральних умовних показників ушкоджень

            і стану навколишнього середовища;

    П     , П     , П      - відповідно комфортне, критичне

     комф.   крит.   реал.   і реальне значення одного

                             з n показників.

4.3. Значення умовних показників ушкодженості (УПУ та ІУПУ) змінюється в межах від 0 (комфортні для життєдіяльності умови) до 1 (критичні умови). Для оцінки рівня ушкодженості об'єктів довкілля пропонується використовувати єдину уніфіковану шкалу (додаток 5).

    4.4. Нормативними    значеннями   ушкоджуваності   для   всіх

біопараметрів, що відповідають умовам стійкого розвитку території,

приймають 30%-ий рівень (тобто УПУ      = 0,300), який знаходиться

                                 норм.

в межах гомеостазу біосистем та при якому можливе  їх  відновлення

після припинення дії негативних факторів.  Для більш точних оцінок

вводяться коефіцієнти значущості для кожного з складових  системи.

Більші  коефіцієнти  встановлюються  для  найбільш чутливих до дії

несприятливих факторів    навколишнього   середовища   параметрів.

З формули 16 виводяться формули 18 та 19,  за  якими  обчислюються

нормативні (П     )    значення    для   кожного   показника   при

            норм.

УПУ = 0,300:

           П      = 0,3 x (П      - П     ) + П     ,        (18)

            норм.           крит.    комф.     комф.

           П      = П      - 0,3 x (П      - П     ),        (19)

            норм.    комф.           комф.    крит.

    Формула 18  використовується  при значеннях П      >  П     ,

                                                 крит.     комф.

а формула 19 - при П      > П

                   комф.    крит.

Нормативні значення для цитогенетичних показників, що використовуються у біологічному моніторингу навколишнього природного середовища, наведені у додатку 6.

    4.5. Інтегральний показник,  що характеризує стан довкілля за

загальним токсико-мутагенним фоном (ІУПУ       ),  обчислюється за

                                       біоінд.

формулою:

    ІУПУ        = 0,4 x ІУПУ  + 0,2 x ІУПУ  + 0,2 x ІУПУ  +

        біоінд.             1             2             3

                         + 0,2 x ІУПУ                        (20)

                                     4

    де ІУПУ        - інтегральний умовний показник ушкодження

           біоінд.   тест-систем біоіндикаторів;

    ІУПУ  - сумарна мутагенна активність довкілля за МЯ-тестом

        1   у дітей;

    ІУПУ , ІУПУ , ІУПУ  - інтегральні показники біоіндикації

        2      3      4   стану атмосфери, гідросфери

                          та педосфери, відповідно.

4.6. Згідно уніфікованої вимірної шкали за цитогенетичними показниками можливо оцінити стан окремих об'єктів і довкілля в цілому за токсико-мутагенним фоном, який відображує сумарну біологічну дію всіх забруднювачів.

4.7. В залежності від визначеної категорії екологічної безпеки за показниками ушкодженості і стану цитогенетичних систем біоіндикаторів пропонуються наступні види управлінських рішень, а саме:

- Безпечний стан територій - характеризується значеннями УПУ в діапазоні від 0,000 до 0,250, при "низькому" і "нижче за середній" рівнях ушкодженості біосистем, і "еталонному" та "сприятливому" їх стані. На таких територіях рекомендується проводити інформаційний періодичний регламентний контроль. В цьому класі виділено підклас з "еталонною" категорією безпечності. Він знаходиться в діапазоні оцінок УПУ від 0,000 до 0,150. Такі території є екологічно чистими, де проявляється лише спонтанні генетично обумовлені зміни. Вони можуть бути рекомендовані в якості контролю;

- Помірно небезпечний стан територій визначається в діапазоні оцінок УПУ від 0,251 до 0,500 при "середньому" рівні ушкодженості біосистем і "задовільно-загрозливому" їх стані. Рекомендується нормуючий періодичний регламентний контроль. В цьому класі рекомендується виділяти підклас з нормативними значеннями для кожного показника (УПУ <= 0,300) з метою визначення причин і ступеня відхилення від нього та шляхів його досягнення;

- Небезпечний стан територій визначається в діапазоні оцінок 0,501-0,750 при "вище за середній" рівень ушкодженості біосистем "критичному" їх стані. Такі території потребують планових тактично-стратегічних дій і постійного контролю, визначення джерел і компонентного складу забруднювачів, а також впровадження реабілітаційних заходів щодо поліпшення стану довкілля і всіх біологічних систем;

- Надзвичайно небезпечний стан територій визначається в діапазоні оцінок 0,751-1,0 при "високому" рівні ушкодженості біосистем і "катастрофічному" їх стані. На таких територіях потребується радикальна зміна тактики і стратегії управлінських рішень. На них повинно проводити особливий регламентний контроль. Необхідно визначення меж таких територій і розробка цілеспрямованих заходів щодо відновлення їх екологічного стану.

5. Критерії вибору умовно-контрольних територій

В системі соціально-гігієнічного моніторингу повинні вибиратися науково обґрунтовані контрольні території на регіональному та державному рівнях. Вони повинні бути екологічно чистими або близькими до них та мати сприятливі умови для життєдіяльності живих істот, включаючи людину. Найбільш придатними для цих цілей є біосферні заповідники і природно-рекреаційні території. Попередні багаторічні дослідження на території заповідних територій АР Крим дозволили обґрунтувати можливість та необхідність їх використання в якості контрольних територій. До таких територій віднесені: заповідники Мис Мартьян і Казантип, Никитський ботанічний сад, район гори Сотера, де за останні 15 років спостерігається безпечна екологічна ситуація за токсико-мутагенною активністю всіх об'єктів довкілля, додаток 7.

Додаток 1

до пункту 3.1.3

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

СУПРОВІДНА ВІДОМІСТЬ

відбору ґрунтових проб

хрунтові проби в кількості ______________________ штук, відібрані

_________________________

___________________ в період з _____________ по _________________

  назва території

науковим співробітником  _________________________

Дата відправлення проб __________________________________________

Підпис виконавця _______________

Розшифровка підпису ____________

Додаток 2

до пункту 3.1.6

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

АНКЕТА

дитини, що обстежується для встановлення цитогенетичних змін в організмі під впливом несприятливих факторів навколишнього середовища

Код особи _____________________

Прізвище ______________ Ім'я __________ По батькові _____________

Стать ________________________ Дата народження __________________

Місце народження ________________________________________________

Адреса проживання дитини ________________________________________

Термін проживання в даному районі (роки) ________________________

Відвідує дитячий заклад (адреса) ________________________________

ДАНІ ПРО МАТІР: місце роботи ____________________________________

Професія ________________________________________________________

ДАНІ ПРО БАТЬКА: місце роботи ___________________________________

Професія ________________________________________________________

Наявність у сім'ї інших дітей (нема - 0,  здорових - 1,  хворих -

2) _______________________________________________________________

Стан здоров'я   дитини   (група  здоров'я  за  даними  останнього

профогляду) ______________________________________________________

__________________________________________________________________

Інфекційні захворювання   в   анамнезі   (за   кожне   перенесене

захворювання 1 бал) ______________________________________________

__________________________________________________________________

Наявність хронічних захворювань (діагноз) _______________________

Наявність частих ГРВІ (4 рази на рік і більше) _________________.

Додаток 3

до пункту 3.3.1

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

КЛАСИФІКАЦІЯ

видів-фітоіндикаторів за стійкістю пилку до дії несприятливих екологічних факторів

Додаток 4

до пункту 3.3.6

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

ХАРАКТЕРИСТИКА

фітоіндикаторів різних груп стійкості за ознакою "Стерильність пилку"

Додаток 5

до пункту 4.3

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

УНІФІКОВАНА ВИМІРНА ШКАЛА

оцінки показників, що характеризують стан об'єктів довкілля за токсико-мутагенним фоном, для прийняття управлінських рішень

Додаток 6

до пункту 4.4

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

НОРМАТИВНІ ЗНАЧЕННЯ

цитогенетичних показників біоіндикаторів якості об'єктів довкілля

Додаток 7

до пункту 5

методичних рекомендацій

"Обстеження та районування

території за ступенем впливу

антропогенних чинників

на стан об'єктів довкілля

з використанням

цитогенетичних методів"

АНАЛІЗ

токсико-мутагенного фону на контрольній території АР КРИМ (мис Мартьян, Казантип, НБС, Сотера)

Примітки:

* - в знаменнику біопараметри у.о. (УПУ);

** - група стійкості рослин.

ЛІТЕРАТУРА

1. ГОСТ 17.1.5.05-85 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков;

2. ГОСТ 28168-89 Почвы. Отбор проб;

3. ГОСТ 17.4.3.01-83 Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб;

4. ГОСТ 17.2.3.01-86 Охрана природы. Атмосфера. Правила контроля качества воздуха населенных пунктов;

5. ГОСТ 17.2.6.01-86 Охрана природы. Атмосфера. Приборы для отбора проб воздуха населенных пунктов;

6. Эколого-гигиенический контроль за применением пестицидов-мутагенов (метод. рекомендации). Киев, ВНИИГИНТОКС, 1989. - 25 с.