ІНСТРУКЦІЯ
ПО ФОТОМЕТРИЧНОМУВИЗНАЧЕННЮ АКТИВНОСТІ ГАММА-ГЛУТАМІЛТРАНСПЕПТИДАЗИ (ГГТ)
В СИРОВАТЦІ КРОВІ
ПРИЗНАЧЕННЯ
Набір призначений для кількісного визначення активності гамма-глутаміл-транспептидази в сироватці крові людини в клініко-діагностичних та біохімічних лабораторіях, науково-дослідницькій роботі.
Набір розраховано на 160напівмікро- (фотометруємий об'єм 3,5 мл) або 80 макровизначень (фотометруємийоб'єм 7 мл) активності ГГТ (з урахуванням холостих та калібру вальних проб).
Діапазон активностей що визначаються - 0,05-5 мккат/л або 3-300 Е/л.
Коефіцієнт варіації у серії -не більш як 5%.
Набір призначено для застосування ін вітро.
ПРИНЦИП МЕТОДУ: Під дією гамма-глутамілтранспептидазиглутаміновий залишок з іу-Ь-(+)-глутаміл-4-нітроаніліда переходить наді пептидний акцептор - гліцилгліцин. При цьому звільняється хромоген -п-нітроанілін. Оптичну щільність реакційного розчину вимірюють після гальмування ферментативної реакції оцтовою кислотою.
СКЛАД НАБОРУ
1. Буферний розчин pH (8,0-8,3) - 1 флакон (50±2) мл;
Гліцилгліцин - (0,5 ± 0,05) моль/л
трис-(гідроксиметил)-аміном етан- (0,5 ± 0,05) моль/л
2. Оцтова кислота - 2 флакони (50±2) мл;
3. Калібратор: розчинп-нітроаніліну (5,4 ± 0,06) ммоль/л - 1 ампула (5±0,5) мл;
4. Субстрат (у-Ь-(+)-глутаміл-4-нітроанілід (85 ± 5) мг) - 4мікро пробірки або 4 таблетки у флаконі.
МАТЕРІАЛ ДЛЯ АНАЛІЗУ
Сироватка. Матеріал стабільний протягом тижня при плюс 4 °С або 3 місяці при мінус 20 °С.
ОБЛАДНАННЯ
Фотометричне обладнання, здатне вимірювати оптичну щільність при (400-430) нм (для спектрофотометру 405 нм) у діапазоні (0-1,0) од. Кювета з довжиною оптичного шляху 10 мм. Пробірки об'ємом 10 мл, колба об'ємом 50 мл, колба мірна об'ємом 1000 мл, мірний циліндр об'ємом 50 мл (ГОСТ 1770-74Е). Піпетки об'ємом 0,1 ,5 та 10 мл (ГОСТ 29227-91). Водяний термостат або баня, здатні термостатирувати пробірки при температурі плюс (37±0,1) °С.
ПРИГОТУВАННЯ РОЗЧИНІВ
Робочий розчин субстрату. Вколбі розчиняють вміст однієї мікро пробірки (чи одну таблетку) з субстратом в 28 мл дистильованої води (підігріти до температури плюс (50±10) °С). Після охолодження, до отриманого розчину додають 12 мл буферного розчину із флакона, перемішують та тримають на водяній бані при плюс 37 °С. Розчин стійкий при температурі плюс 37 °С на протязі 5 годин, при температурі плюс 25 °С напротязі 10 годин або при температурі плюс (4±2) °С протягом тижня (перед наступним вживанням субстрат що випав в осад розчиняють нагріванням на водяній бані).
Розчин оцтової кислоти. Вмістдвох флаконів з оцтовою кислотою переносять в мірну колбу на 1000 мл (при необхідності флакони підігрівають на водяній бані до повного плавлення кислоти), доливають дистильованою водою до риски та перемішують. Розчин стійкий при зберіганні у герметичній тарі.
ПРОВЕДЕННЯ АНАЛИЗУ
Аналіз проводиться згідно зтаблицею:
| Відміряти у пробірку, мл
| Дослідна проба
| Проба зрівняння
|
| Напівмікро аналіз
| Макро аналіз
| Напівмікро аналіз
| Макро аналіз
|
| Робочий розчин
| 0,50
| 1,00
| 0,50
| 1,00
|
| Витримують 5 хв. при температурі плюс 37 °С.
|
| Сироватка крові
| 0,05
| 0,10
| -
| -
|
| Витримують точно 15 хв. при температурі плюс 37 °С.
|
| Розчин кислоти Сироватка крові
| 3,00
| 6,00
| 3,00 0,05
| 6,00 0,10
|
| ПеремІШуЮТЬ Та ВИМІРЯЮТЬ ОПТИЧНу ЩІЛЬНІСТЬ ДОСЛІДНОЇ Проби (Едослід.)
проти проби зрівняння. Фотометрирування - див. розділ " Обладнання".
|
КАЛІБРУВАННЯ
Для побудови калібрувальної кривої готують калібрувальні розчини згідно таблиці:
| Калібру вальни й розчин №
| Калібратор
(мл)
| Дистильована вода (мл)
| Каталітична активність
|
| мккат/л
| Е/л
|
| 1
| од
| ІД
| 0,50
| ЗО
|
| 2
| 0,2
| 1,0
| 1,00
| 60
|
| 3
| 0,4
| 0,8
| 2,00
| 120
|
| 4
| 0,8
| 0,4
| 4,00
| 240
|
| 5
| 1,2
| -
| 6,00
| 360
|
В пробірки відміряють по 0,1 мл отриманих розчинів, додають по 7 мл розчину оцтової кислоти, перемішують та виміряють оптичну щільність проти води при довжині хвилі, при якій виміряласьпроба. Будують калібру вальний графік залежності оптичної щільності від каталітичної активності.
РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ
Користуючись значенням оптичної щільності дослідної проби (Едослід.) знаходять на калібрувальному графіку каталітичну активність ГГТ у дослідній пробі.
РЕФЕРЕНТНІ ВЕЛИЧИНИ
Сироватка мккат/л Е/л
- Чоловіки: 0,25-1,77 15-106
- Жінки: 0,17-1,10 10-66
КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ.
Достовірність отриманого результату перевіряється тестуванням контрольних сироваток " ЛіонормУ"," Ліонорм П" або " Біоконт С".
ПРИМІТКИ
1. Об'єми реагуючих розчинів дозволяється пропорційно змінити, витримуючи співвідношення робочий розчин : сироватка : розчин кислоти = 10 : 1 : 60.
2. Якщо активність ГГТ в матеріалі вище 5 мккат/л або 300 Е/л, його розбавляють в співвідношенні 1:4 фізіологічним розчином. Отриманий результат множать на 5.
3. При температурі повітря нижченіж плюс 18 °С можливе замерзання оцтової кислоти. Для відтавання кислоти необхідно підігріти флакон у теплій воді.
УМОВИ ТА ТЕРМІН ЗБЕРІГАННЯ.
Зберігання набору - при температурі від плюс 2 до плюс 8 °С. Источник
Строк придатності набору - 12місяців від дати випуску (вказана на упаковці)