Про затвердження Методичних рекомендацій "Фенотипові характеристики недифтерійних коринебактерій та їх клініко-епідеміологічне значення

Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення", з метою науково-методичного забезпечення державного санітарно-епідеміологічного нагляду

НАКАЗУЮ:

1. Затвердити методичні рекомендації "Фенотипові характеристики недифтерійних коринебактерій та їх клініко-епідеміологічне значення", що додаються.

2. Департаменту організації санітарно-епідеміологічного нагляду методичні рекомендації "Фенотипові характеристики недифтерійних коринебактерій та їх клініко-епідеміологічне значення" довести до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, зацікавлених міністерств та інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

Контроль за виконанням наказу залишаю за собою.

Перший заступник Міністра - головний державний санітарний лікар України

Г.С.Рожков

                                    ЗАТВЕРДЖЕНО

                                    наказ Міністерства охорони                                      здоров`я України

                                    "____"_____2010 №______

Методичні  рекомендації

"Фенотипові характеристики недифтерійних коринебактерій та їх клініко-епідеміологічне значення"

1. Мікробіологічні особливості недифтерійних коринебактерій та їх роль

у патологічних процесах

Рід Corynebacterium включає коринеформні бактерії, які поширені у навколишньому середовищі. Коринеформні бактерії – це плеоморфні паличковидні грампозитивні мікроорганізми, які згідно з визначником бактерій Берджі входять до групи 20 «Грампозитивні неспороутворюючи палички неправильної форми», яка об’єднує 36 родів. Представники цієї групи є переважно коменсалами слизових оболонок та шкіряних покривів людей і тварин. Серед них слід виділити роди Arachnia, Arcanobacterium, Brevibacterium, Gardnerella, Propionibacterium, які здатні викликати захворювання у людей і мають значення у клінічній практиці.

За типом дихання вони розподіляються на облігатні аероби, факультативні та облігатні анаероби. Мікроорганізми цієї групи гетерогенні за морфологічними особливостями та каталазною активністю, не мають ендоспор, деякі з них здатні рухатися. Для їх клітин характерне розташування у вигляді «V»-форми та палісаду. Деякі види коринеформних бактерій у життєвому циклі проходять фази перетворення паличок у кокоподібні форми з переважанням паличок у молодих культурах, а кокоподібних форм у старіючих культурах. Деякі представники коринеформних бактерій дуже повільно ростуть на середовищах без ліпідів, при цьому на середовищах з 0,5-1,0 % Твін-80 (ефір олеїнової кислоти) ростуть добре і в 1-2 денних культурах формують колонії діаметром близько 1 мм. Такі штами називають «ліпофільними».

Нині коринеформні бактерії розподіляють на роди за особливостями хімічної будови клітинної стінки та нуклеотидного складу хромосомної дезоксирибонуклеїнової кислоти (моль % G+C) (табл. 1). Таксономічне положення багатьох видів коринеформних бактерій переглядається по мірі накопичення нових знань. Досі залишається не визначеним таксономічне положення деяких потенційно патогенних видів. Наприклад, до них відносяться «CDC-ферментуючи коринеформні бактерії», які виділяють із різних біотопів людини.

Застосування нумеричної таксономії та хемотаксономії показало гетерогенність представників роду Corynebacterium і призвело до переносу деяких видів в інші роди. Так, види C. pyogenes та C. haemolyticum були перенесені до роду Arcanobacterium, C. vaginalis – до роду Gardnerella, а вид Bacterionema matruchotii віднесено до роду Corynebacterium. Ряд науковців вважають, що рід Corynebacterium повинен об’єднувати лише ті види, G+C в дезоксирибонуклеїновій кислоті яких складає 52-70 моль %. Таксономічне положення інших видів потребує перегляду.

                                                Таблиця 1.

Таксономічні властивості деяких родів коринеформних бактерій

"ДВ" – дані відсутні;

"-" – результат тесту після 2 діб інкубування негативний у 90-100 % штамів.

1.1. Рід Corynebacterium

Рід Corynebacterium був описаний у 1896 р. Lehmann і Neumann, до нього належать 75 видів морфологічно подібних споріднених мікроорганізмів, у тому числі і збудник дифтерії. Це здебільшого коменсали слизових оболонок та шкірних покривів людей і тварин.

Вони мають вигляд прямих або злегка вигнутих паличок, цитоплазма яких нерівномірно забарвлюється і може мати метахроматичні гранули. У мазках, як правило, розташовуються поодиноко або у парах, часто V-подібної конфігурації, бувають у купках із декількох паралельно розташованих клітин. До такого кутового та палісадного розміщення клітин призводить «клацаючий» (snapping) поділ. Зазвичай ці мікроорганізми нерухливі, грампозитивні, не кислотостійкі, каталазопозитивні; клітинна стінка містить мезодіаміно-пімелінову кислоту, арабіногалактан та коротколанцюгові міколові кислоти (22-36). Вміст пар G+C у хромосомній дезоксирибонуклеїновій кислоті становить 52-70 моль%. Вуглецевий метаболізм змішаний – бродильний та дихальний. Не утворюють розчинних гемолізинів, а у твердих поживних середовищах з кров’ю можливий  гемоліз навколо колоній. Деякі види Corynebacterium утворюють екзотоксин і є патогенними для людини і тварин.

Найбільш поширені види Corynebacterium представлені нижче.

C. diphtheriae. Типовий вид роду, може продукувати екзотоксин і викликати дифтерійне запалення. Детальна характеристика мікроорганізмів цього виду надається у нормативно-інструктивних матеріалах Міністерства охорони здоров’я України.

C. amycоlatum. Вперше представники виду описані у 1988 р. M.D Collins та співавт. Виділені зі шкіри та крові людей із серцевими захворюваннями та у імуноскомпроментованих осіб. Можуть бути збудником ендокардитів, септицемій. C. amycоlatum стійкі до багатьох антибіотиків (ципрофлоксацину, еритроміцину, гентаміцину, пеніциліну), але чутливі до ванкоміцину та рифампіцину. У складі клітинної стінки не мають міколової кислоти, володіють фосфатазною активністю, не ферментують крохмаль, маніт та ксилозу.

C. bovis. У людей описані випадки септицемій та нефритів, зумовлені цим видом коринебактерій. Зазвичай, вони є коменсалами вимені корів, тому часто їх виділяють із коров’ячого молока, та можуть призвести до зменшення або припинення лактації та виникнення маститів у тварин. Морфологічно C. bovis неправильної форми палички та кокопалички. Це ліпофільні мікроорганізми; єдині у роді коринебактерії, позитивні за оксидазою; ферментують глюкозу, фруктозу та гліцерин; нітрати не відновлюють; гемолітичною активністю не володіють.

Після посіву на поживні середовища через 24 години інкубації ріст може бути відсутній або мінімальний, через 48 годин – суттєво помітний. Якщо посів проб молока здійснюється петлею, то колонії розташовуються на початку штриху, де концентрується жир молока, при посіві тампоном - колонії рівномірно розподіляються по поверхні агару. Колонії кремового, сірого або білого кольору, непрозорі, сухі, крихкі, дрібні (близько 1 мм в діаметрі).

C. cуstitidis. У людини частіше всього колонізуються на шкірі та слизових оболонках, особливо у жінок в області паху. Часто є причиною геморагічних циститів, інфекцій припуція та пієлонефритів у пацієнтів похилого віку, з урологічною патологією, після оперативного втручання та у осіб, які приймають антимікробні препарати широкого спектру дії. Зумовлюють підвищення рН сечі та утворення каменів у сечовивідних шляхах. C. cystitidis можуть бути причиною септіцемій та пневмоній у людини.

Виявляються у сечі великої рогатої худоби і зпричиняють геморагічні цистити у тварин.   

Мікроорганізми цього виду дещо меншого розміру, прямі або слабо вигнуті палички з характерним розташуванням; мають фімбрії; ростуть повільно навіть на сироватковому агарі; ліполітики; колонії на поживних середовищах мають білий колір. Характеризуються продукцією кислоти із ксилози та крохмалю; не редукують нітрати; гідролізують казеїн; не гідролізують сечовину.

C. jeіkeium. Входять до складу нормальної мікрофлори шкіри людини. Частіше їх виявляють у чоловіків на шкірі та слизових оболонках пахової, ректальної та аксилярної ділянок тіла. Як патоген для людини, вид вперше описаний у 1970 р. Johnson та Kaye. Ці коринебактерії здатні викликати ураження шкіри, пневмонії, ендокардити, септицемії, перитоніти, запалення ран, часто є причиною септичного тромбофлебіту.

C. jeіkeium – плеоморфні, ліпофільні, ліполітичні, грампозитивні палички з характерним розташуванням, мають метахроматичні гранули; повільно ростуть на поживних середовищах. Вони утворюють кислоту із глюкози та галактози, інколи із мальтози; негативні за уреазою та нітратредуктазою. На середовищі з Твін-80 формують круглі колонії з гладкою поверхнею, від білого до кремового відтінку. Не виявляють гемолітичної активності. Мікроорганізми стійкі до багатьох антибіотиків. Антибіотик вибору – ванкоміцин, препарат резерву – ципрофлоксацин. У випадку госпіталізації, коли хворому призначається тривалий курс антибіотикотерапії, або при виявленні у нього імунодефіцитного стану, виникає ризик колонізації високорезистентними штамами цього виду.

C. kutscheri. Вперше був виділений у 1894 р. Kutscher. Резервуаром цього виду є дрібні гризуни. C. kutscheri вегетують у ротовій порожнині, стравоході, кишечнику і лімфатичних вузлах пацюків та мишей. За морфологією це палички з загостреними краями, забарвлюються нерівномірно; на агарі колонії дрібні, ніжні, жовтувато-білого кольору, непрозорі із зубчатими краями.

C. matruchotii. Коринебактерії цього виду були виявлені у ротовій порожнині людини та приматів. Їх клітини мають батіговидну форму; редукують нітрати.

C. minutissimum. Вперше був описаний у 1983 році. Коринебактерії цього виду є збудниками еритразми, тобто інфекційного ураження шкіри, для якого характерна червоно-коричнева висипка з локалізацією переважно у паху та прилеглих ділянках тіла. C. minutissimum можуть зумовлювати абсцеси легень, ендокардити та фатальні септикопіємії. Ці коринебактерії виявляють у хворих на простатит, що не виключає їх ролі у патогенезі чоловічого безпліддя.

C. minutissimum - короткі плеоморфні палички; уреазонегативні; ферментують мальтозу, сахарозу, глюкозу; продукують піразинамідазу; не редукують нітрати.

C. mycetoides. Відомі як збудники хронічних виразок шкіри. Це короткі палички; уреазонегативні; не ферментують сахарозу та мальтозу.

C. pilosum. Коринебактерії цього виду виявляють в уретрі та піхві здорових корів. Вони можуть бути причиною циститів та пієлонефритів у тварин.

За морфологією це палички малого розміру з характерним для коринебактерій розташуванням; мають пілі, що зумовлюють їх здатність до адгезії, переважно до епітеліальних клітин піхви та дещо менше до епітелію сечовивідних шляхів. На сироватковому агарі утворюють жовті колонії; не ростуть у бульйоні при рН=5,4; здатні до кислотоутворення із крохмалю, при цьому не ферментують ксилозу; відтворюють нітрати; гідролізують сечовину.

C. pseudodiphtheriticum (Hoffmanni). Можуть бути причиною бронхопневмоній у осіб з хронічними системними захворюваннями, яким проводиться імуносупресивна терапія. Зареєстровані випадки виділення їх при септицеміях у людини.

При мікроскопічному дослідженні виявляють короткі прямі палички; метахроматичні зерна відсутні або їх мало; часто розташовані паралельно. Факультативні анаероби. C. pseudodiphtheriticum добре ростуть на простих поживних середовищах за t=(37±1)°С; на кров’яному агарі утворюють білі з кремовим відтінком колонії у вигляді S-форми; на середовищах із телуритом колонії сухі, дрібні, сірі, з коричневим центром; на середовищі Бучина колонії мають блакитний відтінок. Вони не ферментують вуглеводи; не мають нітрітредуктази; розкладають сечовину; токсин не продукують.

C. pseudotuberculosis. Викликають казеозний лімфаденіт у овець та кіз, інколи у коней, великої рогатої худоби, верблюдів та оленів. Збудник уражує людей, які контактують з хворими тваринами, і може призвести до септичного захворювання та грануломатозного лімфаденіту.

Палички забарвлюються нерівномірно; спостерігаються булавовидні форми, які нагадують C. diphtherіае, хоча плеоморфізм виражений у меншій мірі. Колонії дрібні, жовтого кольору, з нерівними краями; на кров’яному агарі утворюють вузьку зону гемолізу; при вирощуванні у бульйоні спостерігається зернистий осад. На середовищах з телуритом колонії однорідні, більш чорного кольору у порівнянні із колоніями дифтерійної палички. C. pseudotuberculosis не редукують нітрати; володіють уреазною активністю; не продукують піразинаміназу, як і C. diphtherіае, також схожі з ними за цукролітичною активністю; рідко гідролізують желатин; утворюють токсин, який має активність фосфоліпази D, сфингомієлінази та проникаючого фактору. Мають аналогічну із C. diphtherіае будову ліпідів клітинної стінки, дезоксирибонуклеїнової кислоти хромосоми цих двох видів коринебактерій подібні на 40 %.

C. renale. У людей, переважно у жінок, викликають цистити та пієлонефрити з ураженням нирок. Часто виявляються на шкірі вимені у здорових корів та у молоці. Ці мікроорганізми є збудниками циститів та пієлітів у великої рогатої худоби, а також захворювань сечових шляхів у домашньої птиці.

C. renale – палички із загостреними краями; мають метахроматичні гранули та фімбрії; володіють гемолітичною активністю. Вони добре ростуть на середовищах із сироваткою з утворенням прозорих колоній із жовтуватим відтінком, здатні рости у бульйоні з рН=5,4; не продукують кислоту із ксилози та крохмалю; не редукують нітрати; розкладають сечовину; у лакмусовому молоці дають винно-червоне забарвлення.

C. xerosis. Виявляються на шкірі та слизових оболонках очей, носа і носоглотки людини, можуть бути причиною ксерози (одна із форм хронічних кон’юнктивітів). Цей вид коринебактерій був виділений від осіб із ендокардитами, пневмоніями, імунодефіцитами, септицемією та хронічною соматичною патологією.

Мікроорганізми цього виду за морфологією схожі на C. diphtherіае, але на відміну від останніх вони більш короткі та товсті, діжкоподібної форми; при фарбуванні виявляється слабковиражена поліхромність та спостерігається поперечна смугастість; метахроматичних гранул не багато, і вони виявляються не завжди чітко. C. xerosis – факультативні анаероби; добре ростуть за t=(22-37)°С, утворюючи через 24 години вирощування на м'ясо-пептонному агарі дрібні, округлої форми колонії, з гладенькою або шорсткуватою поверхнею; добре ростуть на кров’яному агарі, на середовищах із телуритом колонії випуклі, в’язкої консистенції, сірого або коричневого кольору. Мікроорганізми цього виду ферментують глюкозу, мальтозу, сахарозу без газоутворення; сечовину не гідролізують; проба на цистеназу негативна; токсини не продукують. На шкірі людини знаходяться ліпофільні штами, які для свого росту  потребують ліпіди (наприклад, Твін-80).

C. ulcerans. Вперше штами цього виду були виділені із горла людини, а потім від різних видів тварин. У людей зазвичай викликають респіраторні ураження; фарингіти, які схожі з дифтеритичним запаленням; можуть бути причиною ангін, тонзилітів, а також уражень шкіри. У 90 % випадків штами C. ulcerans можуть продукувати екзотоксин, який за антигенною структурою відрізняється від екзотоксину C. diphtherіае, проте за патогенетичною дією подібний до дифтерійного токсину.

C. ulcerans патогенні для великої рогатої худоби і є причиною гострих та субклінічних маститів у корів. Зараження людей цими мікроорганізмами відбувається через інфіковане молоко та забруднену тару.

За морфологією це короткі палички. На поживних середовищах утворюють дрібні колонії, які легко знімаються бактеріологічною петлею. Уреазопозитивні; не продукують піразинамідазу та нітратредуктазу. Коринебактерії цього виду чутливі до багатьох антибіотиків.

C. striatum. Цей вид коринебактерій виділяють із носоглотки та шкіри людей, проте вони рідко викликають у них захворювання. C. striatum можуть бути збудником маститів у корів. Ці мікроорганізми уреазонегативні; мають піразинамідазу та нітратредуктазу.

C. flavescens. Не патогенні для людини. Це поліморфні дрібні палички; асимілюють глюкозу; не ферментують мальтозу та сахарозу; не мають піразинамідази та уреази.

C. glucuronolyticum (синонім C. seminale). Це новий вид, представники якого були виділені із сперми інфертильних чоловіків. Штами, які виділяють від хворих людей, можуть бути асоційовані з безпліддям чоловіків, уретритами і вагинозом. Клінічне значення виду остаточно не встановлено. Можливо, є коменсалами сечостатевих шляхів людини і свиней.

Слід відмітити, що більшість коринебактерій колонізують організм людини без клінічних проявів та імунологічних змін, тобто є коменсалами (табл. 2), а деякі з них навіть приносять користь організму людини. Так, під час колонізації бактерій на загиблому пласту поверхневого епітелію шкіри, вони споживають продукти біохімічного розпаду, які є шкідливими для організму людини.

                                                Таблиця 2.

Частота виявлення недифтерійних коринебактерій на різних анатомічних ділянках тіла людини

"-" –  не виявляються

2. Клініко-епідеміологічна характеристика  захворювань,  які викликають недифтерійні коринебактерії

Недифтерійні коринебактерії (дифтероїди) поширені в об’єктах довкілля (вода, грунт, рослини) та серед тварин і людей. Наявність у дифтероїдів факторів патогенності – нейрамінідази, гіалуронідази, сфінгомієлінази, здатності до адгезії та інше, обумовлюють патологічні процеси у людей. Більшість фахівців вважають, що види коринебактерій, які патогенні для тварин, можуть стати причиною нового зооантропонозу чи опортуністичної інфекції у людини.

На сучасному рівні описані випадки виразково-некротичних захворювань людини, що пов’язані з деякими видами недифтерійних коринебактерій, які характеризуються ураженнями шкіри, ротоглотки, носу, трахеї, легень, тощо. Доведена роль цих мікроорганізмів у розвитку фарингітів, пневмоній, абсцесів, ендокардитів, септицемій, захворювань нирок та статевих органів у людей. Так, C. minutissimum описаний як збудник шкірних уражень; C. ulcerans можуть викликати дифтерієподібні захворювання з ураженням слизових оболонок верхніх дихальних шляхів; C. рseudotuberculosis – абсцеси з виразково-некротичними осередками, виразковими лімфаденітами; C. xerosis – у випадку попадання у сльозний канал можуть стати причиною тривалого та в’ялого перебігу кон’юнктивітів; C. pseudodiphtheriticum, які часто колонізують слизові оболонки носу, глотки, поверхню шкіри та слуховий канал, можуть викликати запальні процеси у легенях у імуноскомпроментованих осіб.

За останні 20-30 років етіологія інфекційного ендокардиту та інфекційно-запальних ускладнень протезування  клапанів серця суттєво змінилася. Все більше значення у виникненні цієї патології набуває умовно-патогенна мікрофлора, серед якої 8-10 % припадає на C. amycоlatum, C. pseudodiphtheriticum, C. jeіkeium  та C. striatum.

У 80 % дітей, які часто та тривало хворіють, уражаються органи дихання. Захворюваність у цій групі дітей характеризується підвищеною частотою, тривалістю, тяжкістю, тенденцією до хронічного та рецидивуючого перебігу патологічного процесу. Серед ускладнень інфекцій верхніх дихальних шляхів на першому місці стоять синусити, отити, тонзилофарингіти, етіологічним фактором яких у 1,6-10,0 % випадків є недифтерійні коринебактерії.

C. jeіkeium виділяється у 1-2 % здорових людей, у 35-50 % онкологічно хворих, у 40 % осіб, госпіталізованих з приводу захворювань шкіри, та у 10-15 % осіб з іншою патологією. Є дані про виявлення мікроорганізмів цього виду у крові та інших біотопах людей, які отримували імуносупресивну терапію після пересадки кісткового мозку. Практично кожен такий випадок супроводжувався септицемією, що особливо небезпечно для хворих з патологією кровотворення та судинними шунтами. Сепсис, як одна із найбільш грізних форм ускладнення інфекційного процесу, зазвичай розвивався на фоні основного захворювання при наявності у пацієнтів катетерів, шунтів та трубок із біоматеріалів. Більшість випадків зараження мали госпітальний характер і були небезпечні для осіб з порушенням стану імунної системи.

У період останньої епідемії дифтерії (1990-ті роки) у 5,7 % хворих із запальними захворюваннями верхніх дихальних шляхів виділяли дифтероїди як окремо, так і в сукупності з токсигенними та нетоксигенними штамами C. diphtheriae. При комбінованій інфекції (дифтероїди та C. diphtheriae) клінічні ознаки та характер ускладнень повністю співпадали з клінікою дифтерійної інфекції. Найчастіше у хворих з підозрою на дифтерійну інфекцію виділяли C. ulcerans, C. pseudotuberculosis. Зазначені недифтерійні коринебактерії спроможні синтезувати  високоактивні екзотоксини, які можуть спричиняти патологічні процеси у людини, схожі за клінічною симптоматикою на перебіг дифтерійної інфекції. Слід відзначити, що екзотоксин недифтерійних коринебактерій, який за патогенною дією подібний до дифтерійного токсину (викликає міокардити, поліневрити, токсичний нефроз), відрізняється від останнього антигенними властивостями, що обумовлює відсутність терапевтичної ефективності протидифтерійної сироватки у частини хворих із дифтерієподібними захворюваннями.

У значної кількості людей у ротовій порожнині зустрічаються недифтерійні коринебактерії. Характерною особливістю їх є здатність (при зростанні рівня обсіменіння) понижувати окислювально-відновлюючий потенціал, утворюючи цим умови для росту анаеробів. При захворюваннях на пародонтоз недифтерійні коринебактерії зустрічаються в асоціації з фузобактеріями та спірохетами.

Відомості про окремі види недифтерійних коринебактерій, етіологічна роль яких у виникненні патологічних станів доведена, представлені у таблиці 3. При виділенні із крові, спинномозкової рідини та інших, зазвичай стерильних біосубстратів, усі перераховані види коринебактерій слід оцінювати як потенційні збудники, і необхідно проводити терапевтичні заходи.

У теперішній час епідемічний процес захворювань, які викликають недифтерійні коринебактерії, характеризується спорадичною захворюваністю та поліморфізмом клінічного перебігу. Шляхи передачі збудників інфекції недостатньо з’ясовані. Ряд авторів висловлюють припущення про домінування контактно-побутового, інші  про повітряно-крапельний шлях передачі.

Для встановлення ролі недифтерійних коринебактерій при виникненні патологічних процесів у людини необхідна біохімічна диференціація цих мікроорганізмів, знання їхніх біологічних особливостей та основних клінічних симптомів захворювань, які вони спричиняють.

Правильно поставлений діагноз та початок ефективної етіотропної терапії інфекційного захворювання залежить від взаємодії практичного лікаря та лабораторної служби. Головне питання, яке цікавить лікаря-клініциста після отримання результату, полягає в тому, чи є виявлений мікроорганізм етіологічним агентом захворювання. Тому, проблема чіткого визначення ситуації, при якій має місце колонізація чи розвиток інфекційного захворювання організму, є важливим завданням клінічної мікробіології.

В останні роки, внаслідок зростання числа імуноскомпроментованих осіб, суттєво розширилося уявлення про роль мікроорганізмів-коменсалів, які за певних умов сприяють виникненню маніфестних форм інфекційних хвороб. Зростання медикаментозної резистентності у цих мікроорганізмів ускладнює перебіг хвороби і може призвести до її летального результату у осіб з імунодефіцитним станом, кількість яких постійно зростає.

При бактеріологічному дослідженні матеріалу від хворих з підозрою на дифтерію та при гнійно-запалювальних процесах доцільно проводити також дослідження на наявність дифтероїдів, як у період епідемічного підйому дифтерії, так і в міжепідемічний період.

                                           Таблиця 3.

Клінічне значення окремих видів мікроорганізмів роду Corynebacterium

3. Фенотипові властивості недифтерійних коринебактерій та хід лабораторного дослідження  при їх ідентифікації

    Рід Corynebacterium включає 75 видів, причому деякі з них мають невизначене таксономічне положення (наприклад, C. genitalium). У більшості видів проявляються варіабельні біохімічні реакції.

    3.1. Фенотипова ідентифікація видів мікроорганізмів роду Corynebacterium

    Для ідентифікації видів роду Corynebacterium використовують таблицю 20.10 визначника бактерій Берджі. Проте у цій таблиці відсутні відомості про визначення цистанази, ферментації маніту, диференційні ознаки виду C. ulcerans тощо. Враховуючи виявлені недоліки та використовуючи особистий досвід роботи, посилаючись на фахові джерела інформації, була створена адаптована та інформативна таблиця для ідентифікації 20 видів недифтерійних коринебактерій (табл. 4). У цій таблиці всі види роду Corynebacterium розділені на 5 груп за ознаками відсутності ферментації глюкози (C. pseudodiphtheriticum), мальтози (C. striatum, C. flavescens, C. mycetoides, C. xerosis), манози (C. bovis, C. cуstitidis, C. jeіkeium), сахарози (C. pilosum, C. renale,, C. ulcerans) та лактози (C. amycоlatum, C. callunae,C. glutamicum, C. matruchotii, C. minutissimum, C. pseudotuberculosis, C. vitarumen, C. kutscheri).

                                                Таблиця 4.

Фенотипова ідентифікація видів мікроорганізмів роду Corynebacterium  

(Ж.М. Маніна, О. В. Шаповалова, С.В. Бірюкова, 2008)

* всі інші види ферментують глюкозу; «+» – результат тесту позитивний на 1-2 добу інкубування у 90-100 % штамів; «-» – результат тесту негативний після 2 діб інкубування у 90-100 % штамів; «V» – ознака варіабельна, результат тесту позитивний у 26-75 % штамів; «ДВ» – дані відсутні; мл – мальтоза; сах – сахароза; мн – маніт; окс – оксидаза; кр – крохмаль; кс –  ксилоза; гал – галактоза.

Серед інших тестів біохімічної ідентифікації запропоновано використовувати п’ять найбільш інформативних: визначення уреази, лужної фосфатази, піразинамідази, нітратредуктази та оцінку ступеня кислотоутворення при ферментації глюкози – тест з метиловим червоним. Для штамів з варіабельними ознаками приведений перелік додаткових тестів.

В окрему таблицю 5 було зведено мінімальний набір біохімічних тестів для видової ідентифікації коринебактерій, які відіграють роль в урогенітальній патології (C. renalе, C. pilosum, C. cуstitidis).

                                                Таблиця 5.

Диференціація видів C. renalе, C. pilosum, C. суstitidis за фенотиповими ознаками

"+" – результат тесту позитивний на 1-2 добу інкубування у 90-100 % штамів; "-" – результат тесту негативний після 2 діб інкубування у 90-100 % штамів.

Короткий біохімічний ряд тестів (кислотоутворення із ксилози та крохмалю, наявність ферменту нітратредуктази) та морфологічні особливості культур надають можливість ідентифікувати недифтерійні коринебактерії у повсякденній практиці бактеріологічних лабораторій закладів охорони здоров’я.

3.2. Хід лабораторного дослідження

Матеріалом для мікробіологічного дослідження можуть бути: зскрібки та слиз із уражених ділянок шкіри і слизових оболонок, кров, виділення з вимені, сперма, тощо.

Перший день. Первинний посів матеріалу на будь-яке середовище для первинного засіву (кров’яний агар, сироватковий агар, кров’яно-телуритовий агар) методом виснажуючого посіву для оцінки мікробіологічного обсіменіння (наприклад, за методом Голда). Посів інкубують за t=(37±1)°С протягом 18-20 годин.

Посів крові та облік росту проводять з використанням спеціальних середовищ відповідними методами.

Другий день. Вивчення морфології колоній: колонії S-форми мають правильну, округлу форму, 1-4 мм в діаметрі, непрозорі, на середовищах з телуритом калію мають чорний або сірий колір, з гладенькою поверхнею, з рівними краями та випуклим центром, блискучі, в’язкі, вологі; колонії R-форми часто неправильної округлої форми з нерівним краєм, матовою шорсткою поверхнею, сухі, ламкі.

Вивчення гемолітичної активності культур та підрахунок їх кількості.

Мікроскопія мазків. Виявлення поліморфності культури: грампозитивні булавовидні, діжкоподібні клітини, розташовані у вигляді палісаду чи літери "V", із зернами (гранулами) волютину.

Відсів ізольованих колоній на сироватковий агар для накопичення чистої культури. Посів на м’ясо-пептонний агар.

Третій день. Мікроскопія культури з сироваткового агару. Оцінка здатності культури рости на м'ясо-пептонному агарі. Постановка тестів на каталазу та оксидазу. Посів на середовище для визначення рухливості у 2 пробірки із стовпчиком 0,3 % напіврідкого агару. Пробірки із посівом інкубують при різних температурах – одну за t=(22±1)°С, другу за t=(37±1)°. Посів на ряд диференційнодіагностичних середовищ для вивчення біохімічної активності (ферментація цукрів, крохмалю, наявність нітратредуктази, лужної фосфатази, цистенази, піразинамідази, уреази, тирозинази, тест з метиловим червоним). Посів у цукровий бульйон.

Четвертий день. Облік результатів посіву на рухливість мікроорганізмів та оцінка характеру росту в цукровому бульйоні: при утворенні поверхневої плівки – аероб; при дифузному рості по всьому об’єму середовища – мікроаерофіл. Оцінка результатів біохімічних тестів.

Ідентифікація культур: до роду Corynebacterium можна віднести нерухливі, каталазопозитивні, цитохромоксидазонегативні (за винятком C. bovis), негемолітичні (рідко α-гемоліз), грампозитивні палички (кокопалички) з характерним розташуванням у мазку.

Видову ідентифікацію культур проводять на підставі оцінки результатів біохімічних тестів, представлених у таблицях 4 та 5.

Результати мікробіологічного дослідження видають із зазначенням виду мікроорганізму та його кількості у біологічному матеріалі.

При необхідності збереження штамів, їх пересівають уколом у стовпчик 0,3 % (напіврідкого) агару, який містить 10 % конячої сироватки. Поверхню агару залити стерильним вазеліновим маслом для попередження висихання. У такому вигляді культури зберігалися при t=4°С впродовж 3-6 місяців. Для нетривалого зберігання (до 1 місяця), штами пересівають на скошений агар.

Аналіз результатів дослідження дозволяє рекомендувати наведені у методичних рекомендаціях діагностичні таблиці для практичного застосування у бактеріологічних лабораторіях лікувально-профілактичних закладів охорони здоров’я при визначенні виду недифтерійних коринебактерій та інших грампозитивних паличковидних бактерій.

Недоліки рутинних фенотипових тестів щодо визначення особливостей бактерій можна подолати при використанні сучасних молекулярно-біологічних методів дослідження по мірі їх впровадження в практику бактеріологічних лабораторій.

4. Диференційна діагностика найбільш значущих у клінічній практиці

коринебактерій

    Рання діагностика дифтерії, у першу чергу, базується на клініко-епідеміологічних даних. При первинному зверненні по медичну допомогу діагноз "дифтерія" ставиться згідно з клінічною симптоматикою. Зазвичай, не виникає проблем у постановці діагнозу при типовому перебігу дифтерійної інфекції (фібринозний наліт, який щільно спаяний з поверхнею тканини, на слизовій оболонці ротоглотки; симптоми інтоксикації та місцевого запалення; збільшення лімфатичних вузликів та ін.), у такому випадку лабораторні методи використовують як додаткові. Практично неможливо поставити правильний діагноз при атипових формах та незвичайній локалізації (шкіра, очі, статеві органи), які часто проявляються у вигляді катаральних та катарально-виразкових уражень. Так, при дифтерії шкіри спостерігається імпетигінозна висипка та ушкодження, що тривало не загоюються, відсутні температурна реакція та прояви інтоксикації. Аналогічні симптоми захворювання шкіри можуть бути обумовлені і недифтерійними коринебактеріями У таких випадках обґрунтована діагностика дифтерійної інфекції повинна базуватися на результатах лабораторного обстеження хворого.

Зважаючи на це, виникає потреба у знаннях не тільки біологічної характеристики збудника дифтерії, а також комплексу диференційно-діагностичних ознак, які допоможуть відрізнити всі біоваріанти C. diphtheriae від недифтерійних коринебактерій, зокрема патогенних (C. ulcerans, C. pseudotuberculosis) та тих, що за певних умов можуть викликати захворювання у людини (C. pseudodiphtheriticum, C. xerosis).

    Усі види коринебактерій (табл. 6), крім C. pseudodiphtheriticum та C. хerosis, є цистиназопозитивними. Піразинамідаза відсутня у трьох патогенних видів (C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis), нітрати не відновлюють варіант C. diphtheriae belfanti та види C. ulcerans і C. рseudotuberculosis. Сечовину не розщеплюють усі варіанти C. diphtheriae та C. хerosis.

Схожість морфологічних, тинкторіальних та біохімічних властивостей коринебактерій із збудниками лістеріозу (рід Listeria), еризипелоїду (збудник - бактерії роду Erysipelothrix), представниками роду Arcanobacterium потребує проведення диференційної діагностики між коринебактеріями та цими мікроорганізмами. Тільки ідентифікація ізольованих мікроорганізмів, кількісна оцінка обсіменіння ними біологічного матеріалу, дослідження рівня специфічних антитіл в сироватці крові хворих та інших змін показників імунного статусу дозволять визначити їх роль у етіології захворювання. Тести для диференціації грампозитивних паличковидних бактерій представлені у таблиці 7 та схемі.

                                                                                                                                                                          Таблиця 6.

Біохімічні властивості видів коринебактерій, які найчастіше виділяються в бактеріологічних лабораторіях медичних установ

"+" – результат тесту позитивний на 1-2 добу інкубування у 90-100 % штамів;

"-" – результат тесту негативний після 2 діб інкубування у 90-100 % штамів.

Таблиця 7. Тести для диференціації Corynebacterium spp. від деяких родів

грампозитивних паличковидних бактерій

"+" – результат тесту позитивний на 1-2 добу інкубування у 90-100 % штамів;

"-" – результат тесту негативний після 2 діб інкубування у 90-100 % штамів;      "V" – ознака варіабельна, результат тесту позитивний у 26-75 % штамів.

Схема ідентифікації грампозитивних паличок,

які мають клінічне значення

КАТАЛАЗА

      +                                                                                                 -

Corynebacterium spp.                                                 Lactobacillus spp.

Спорові грампозитивні                                             Erysipelothrix spp.

паличковидні бактерії                                               Arcanobacterium haemolyticum

Listersa spp.                                                               Arcanobacterium pyogenes

ЦИТОХРОМОКСИДАЗА

      +                                                                                             -

Спорові грампозитивні                                                        Corynebacterium spp.

паличковидні бактерії                                                          Erysipelothrix spp.

Corynebacterium bovis                                                           Listeria spp.

РУХЛИВІСТЬ

      +                                                                                           -

Спорові грампозитивні бактерії                                               Corynebacterium spp.

Listerіa spp (при t=22°C)                                                              (при t=(22-37)°C)

                                                                                                     Erysipelothrix spp.

ПІРАЗІНАМІДАЗА

+                                                                                              -

Недифтерійні Corynebacterium spp.                                      C. diphtheriae

(крім C. flavescens)                                                                  C. ulcerans

                                                                                                  C. рseudotuberculosis

УРЕАЗА

          +                                                                                       -

C. ulcerans                                                                                C. diphtheriae

C. рseudotuberculosis

НІТРАТРЕДУКТАЗА

      +                                                                                      -

C. diphtheriae                                                                           C. ulcerans

(крім C. diphtheriae var. belfanti)                                          C. рseudotuberculosis

4. Висновки

Встановлення нових факторів патогенності умовно-патогенних коринебактерій дозволило визначити їх етіологічну роль у патологічних процесах. Це сприяло перегляду ряду тестів та методів дослідження для ідентифікації недифтерійних коринебактерій. Особлива увага приділяється біохімічній характеристиці, яка є домінантною при ідентифікації видів коринебактерій та для диференціації їх від інших родів грампозитивних паличковидних бактерій.

Одержані нами результати дозволяють рекомендувати наведені у методичних рекомендаціях діагностичні таблиці для застосування в клінічній практиці для ідентифікації коринебактерій та інших грампозитивних паличковидних бактерій, які найчастіше  виділяються із різного біоматеріалу в бактеріологічних лабораторіях медичних закладів.

При патологічних процесах на шкірі, у ротовій порожнині, верхніх дихальних шляхах, серцево-судинній та інших системах організму комплексне бактеріологічне дослідження доцільно доповнити обстеженням на наявність коринеформних бактерій, що дозволить оптимізувати лікування таких хворих з урахуванням етіопатогенезу захворювання.

Впровадження в практику охорони здоров’я запропонованих тестів щодо виявлення недифтерійних коринебактерій дасть можливість поліпшити діагностику інфекційних хвороб, обумовлених цими мікроорганізмами, та усунути помилки при диференційній діагностиці дифтерії.

Директор Департаменту організації

санітарно-епідеміологічного нагляду                                           Л.М. Мухарська

В.о. директора Департаменту розвитку

медичної допомоги                                                                         М.К. Хобзей

Перелік рекомендованої літератури

1. Маніна Ж.М., Шаповалова О.В., Бірюкова С.В. Видова ідентифікація умовно-патогенних коринебактерій // Лабораторна діагностика. – 2008. – № 1 (43). – С. 70-74.

2. Митус Н.В. Особливості перебігу запальних захворювань верхніх дихальних шляхів, зумовлених дифтероїдами. – Автореф. дис. канд. мед. наук. – Київ, 2002. – 18 с.

3. Наказ МОЗ України № 192 від 03.08.1999 р. „Про заходи щодо покращання бактеріологічної діагностики дифтерії в Україні”.

4. Daniels C., Schoors D., Van Camp G. Native valve endocarditis with aorta-to-left atrial fistula due to Corynebacterium amycolatum // Eur. J. Echocardiogr. – 2003. – №4. – Р. 68-70.

5. Knox K., Holmes A. Nosocomial endocarditis caused by Corynebacterium amycolatum and other nondiphtheriae corynebacteria // Emerg. Infect. Dis. – 2002. – №1. – Р. 97-99.

6. First report of prosthetic mitral valve endocarditis due to Corynebacterium striatum: successful medical treatment. Case report and literature review / Mashavi M., Soifer E., Harpaz D., Beigel Y. // J. Infect. – 2006. – №52. – Р.139-141.  

7. Corynebacterium jeikeium endocarditis: a systematic overview spanning four decades /Mookadam F., Cikes M., Baddour L.M. [et al.]// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2006. – №25. – Р. 349-353.

8. Stoddart B., Sandoe J., Denton M. Corynebacterium striatum endocarditis masquerading as connective tissue disorders // Rheumatology. – 2005. – № 44. – Р. 557-558.