Визначення кількості біфідобактерій у кисломолочних продуктах

1. Загальні положення
1.1 Основними представниками нормальної кишечної мікрофлори є анаеробні мікроорганізми, серед яких значне місце займають біфідобактерії. Здоров'я дитини у перші роки життя багато в чому залежить від вмісту біфідобактерій в кишечнику. З віком частка біфідобактерій в загальному біоценозі здорової людини знижується, однак залишається домінуючою групою.
1.2 Вироблені з використанням біфідобактерій кисломолочні продукти набувають лікувальних властивостей внаслідок того, що в них накопичуються в процесі життєдіяльності заквашувальних мікроорганізмів ферменти, амінокислоти, органічні і антибактеріальні речовини. Найчастіше у виробництві використовуються п'ять видів біфідобактерій: B.bifidum, B. longum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis
1.3 Корисні властивості біфідобактерій добре поєднуються з харчовими і дієтичними властивостями молока, в той же час коров'яче молоко не є адекватним середовищем для біфідобактерій, тому традиційні технології виробництва молочних продуктів з їх використанням виявилися малопридатними.
1.4 Для виробництва кисломолочних продуктів використовують переважно заквашувальні препарати, в яких біфідобактерії поєднуються з іншими мікроорганізмами, в основному молочнокислими, тому визначення вмісту біфідобактерій доволі складне. Це питання вирішується застосуванням спеціальних розчинів, які запобігають розвитку супутньої мікрофлори та не діють на біфідобактерїї.
2. Нормативні посилання

3. Методи відбору проб
3.1 Відбір проб - за ГОСТ 9225, ГОСТ 10444.11.
3.2 Для аналізу відбирають 3 одиниці споживчої тари методом випадкової вибірки.
3.3 Посуд з пробою або пробу в споживчій тарі супроводжується якісним посвідченням, актом відбору, в яких вказують:
- номер проби;
- найменування продукту;
- номер і об'єм партії;
- дату і годину відбору проби;
- посаду і підпис особи, яка відбирала пробу;
- позначення діючої нормативної документації, згідно з якою вироблявся продукт.
3.4 Пробу, яку відправляють в лабораторію за межі даного підприємства, пломбують або опечатують і супроводжують якісним посвідченням, направленням, протоколом та актом відбору зразків, у яких вказують:
- номер проби;
- найменування підприємства-виготовника;
- найменування продукту;
- номер і об'єм партії;
- дату і годину вироблення продукту з моменту закінчення технологічного процесу;
- дату і годину відбору проби;
- посаду і підпис особи, яка відбирала пробу;
- обсяг необхідних аналізів;
- позначення діючої нормативної документації, згідно з якою вироблявся продукт.
- посаду і підпис посадової особи підприємства, на якому здійснюється контроль продукту.
3.5 Мікробіологічні аналізи продукту проводять не пізніше, ніж через 4 години з моменту відбору проб.
3.6 Проби повинні зберігатись і транспортуватись до початку досліджень при температурі 4±2° С, не допускаючи при цьому підморожування.
4. Засоби вимірювальної техніки, обладнення, реактиви, матеріали
Агар мікробіологічний за ГОСТ 17206-84;
баня водяна з терморегулятором;
бромтимоловий синій за ТУ 6-09-20-86-77;
вата медична гігроскопічна за ГОСТ 5556-81;
випромінювач бактерицидний настінний;
вода очищена аналітичної якості, або вода дистильована за ГОСТ 6709-72;
вода питна за ГОСТ 2874-82;
воронки скляні за ГОСТ 25336-82;
глюкоза, ч. за ГОСТ 6038-79;
годинник механічний сигнальний за ГОСТ 3145-84;
годинник пісковий настільний на 1,5 та 10 хв;
D-лактоза, 1-водна за ТУ 6-09-22-98-79;
іономер універсальний ЕВ-74 або потенціометр рН-340 за ГОСТ 9245-79;
екстракт кукурудзи згущений за ТУ У 18.243-95;
електроплитка за ГОСТ 14919-83;
ефір для наркозу;
калій двохромовокислий (біхромат калію) за ГОСТ 4220-75;
калію гідрооксид за ГОСТ 4328-77;
калій фосфорнокислий двохзаміщений 3-водний за ГОСТ 2493-75;
каструлі емальовані за ГОСТ 24778-81;
кислота аскорбінова - за ГФ СССР. Х ст.6;
кислота молочна харчова за ГОСТ 490-79;
кислота сірчана, ч. за ГОСТ 4204-77;
кислота соляна, х. ч. за ГОСТ 3118-77;
колби виконання 2, 2-го класу точності, об'ємом 100, 200, 500, 1000 (см3) за ГОСТ 1770-74Е;
літій хлористий (Lithium chloride L 4408) - реактив фірми Sigma;
магній сірчанокислий, 7-водний за ГОСТ 4165-78;
марля медична за ГОСТ 9412-77;
метиленовий блакитний;
мікрокалькулятор;
мікроскоп біологічний з імерсійною системою за ГОСТ 8284-78;
налідиксова кислота (Nalidixic acid N 8878) - реактив фірми Sigma;
натрію гідрокарбонат за ГОСТ 4201-79;
натрію гідроокис, ч.д.а. за ГОСТ 4328-77;
натрію цитрат тризаміщений за ГОСТ 22280-87;
натрій хлористий (натрію хлорид) за ГОСТ 4233-77;
неоміцин сульфат (Neomycin sulfate N 1876) - реактив фірми Sigma;
ножиці медичні за ГОСТ 21239-89;
олівець або маркер для скла;
освітлювач до мікроскопу типу ОІ-9, ОІ-18 або інших марок;
палички скляні;
папір фільтрувальний лабораторний за ГОСТ 12026-76;
паромоміцин сульфат (Paromomycin sulfate P 9297) - реактив фірми Sigma;
пептон ферментований сухий для бактеріологічних поживних середовищ за ГОСТ 13805-76;
пергамент за ГОСТ 1341-84;
печінковий відвар;
петлі бактеріологічні;
пінцет медичний за ГОСТ 21241-89;
піпетки виконання 5, 1, 2-го класів точності, об'ємом 1 см3;
пляшки скляні для хімічних реактивів за ГОСТ 15844-92;
пробірки типові П1, П2 (діаметром 16 мм, висотою 150 мм і діаметром 21 мм, висотою 200мм) за ГОСТ 25336-82;
середовище кукурудзяно-лактозне (ГМК-1) для біфідобактерій;
система очищення води (дистилятор електричний);
скельця предметні для мікропрепаратів за ГОСТ 6672-75;
спирт етиловий ректифікований технічний за ГОСТ 18300-87;
спиртівки лабораторні скляні за ГОСТ 23932-90 або газові пальники;
стакани типу ВН об'ємом 100, 200 см3;
стерилізатори парові медичні або аналогічні за ГОСТ 19569-89;
стерилізатори медичні парові та повітряні за ГОСТ 27437-87;
сумки холодильники;
терези лабораторні загального призначення, 2-го і 4-го класу точності за ГОСТ 24014-80Е;
термометр ртутний з діапазоном вимірювання від 0о до 100оС, з ціною поділки шкали 10С за ГОСТ 13646-68;
термометр рідинний (не ртутний) з діапазоном вимірювання від 0о до 100оС, з ціною поділки шкали 1оС за ГОСТ 28498-90;
термометри спиртові для контролю температури в холодильниках;
термостати електричні для вирощування бактерій з автоматичним терморегулятором ТС-80 та інші аналогічні марки;
тести для контролю роботи стерилізаторів;
хлороформ, за ГОСТ 20015-88;
холодильник побутовий електричний за ГОСТ 16317-87;
чашки бактеріологічні (Петрі) за ГОСТ 23932-90 або полістиролові;
циліндри виконання 1, об'ємом 100, 500 (см3) за ГОСТ 1770-74Е;
цистеїн солянокислий (L-cystein hydrochloride C 4820) - реактив фірми Sigma.
шуттель-апарат;
шафа сушильна стерилізаційна, яка підтримує температуру (160±5)оС;
шпагат за ГОСТ 16266-70;
шпателі металеві або порцелянові 15-20 см за ГОСТ 10778;
штатив пластмасовий за ГОСТ 12026 або металевий.
Дозволяється використовувати інші засоби вимірювальної техніки, обладнання, реактиви, матеріали, які за технічними характеристиками подібні вказаним вище і дозволені до використання в Україні.
5. Підготовка посуду і матеріалів
5.1 Весь новий посуд, який призначений для контролю кількості біфідобактерій, кип'ятять у підкисленій воді (розчин соляної кислоти з об'ємною часткою 1-2%) протягом (15±5) хв і потім обполіскують дистильованою водою. Посуд, який був у використанні, миють 0,5%-ним лужним розчином за допомогою йоржів та щіток, обполіскують водопровідною водою. Сильно забруднений посуд зі слідами жиру, фарби, імерсійної олії занурюють на 2 год у хромову суміш, підігріту до 40 - 45°С, потім ретельно промивають проточною водопровідною водою.
5.2 Вимитий посуд висушують при кімнатній температурі або гарячим повітрям.
5.3 Предметні скельця після мийки та обполіскування обсушують чистою серветкою або занурюють у склянку з притертою пробкою в суміш етилового спирту і наркозного ефіру у співвідношенні 1:1.
5.4 Лабораторний посуд перед використанням обов'язково стерилізують. Стерилізацію здійснюють сухим жаром у сушильній шафі при температурі (160±5)°С протягом 150 хв. або паром в стерилізаторі при 2 атм (134±1)°С протягом (60±1) хв.
5.5 Пробірки, флакони, пляшки, колби закривають ватно-марлевими пробками. Зверху пробки (крім пробірок) обгортають паперовим ковпачком, який обв'язують навколо горла ниткою.
Гумові, коркові, скляні пробки, обгорнуті в папір, стерилізують окремо.
5.6 Стерильний посуд зберігають в герметично закритих шафах або ящиках з кришками. Термін зберігання стерильного посуду - не більше 30 діб, якщо обгортка не порушена.
6. Приготування поживних середовищ і реактивів
6.1 Ізотонічний (фізіологічний) 0,85%-ний розчин натрію хлористого Для приготування ізотонічного розчину активною кислотністю (70,±0,1) од. рН використовують дистильовану воду, рН якої перевіряють індикатором бромтимоловим синім. При його додаванні колір води повинен бути пляшково-зелений. В іншому разі воду не використовують.
В 1 дм³ води розчиняють 8,5 г натрію хлористого, розливають розчин у чисті пробірки діаметром 18-20 мм по 10 см³, а в колби по 93 см³ і стерилізують протягом (20±1) хв при температурі (121±1)°С.
6.2 Розчин натрію гідрокарбонату для нейтралізації 10 г натрію гідрокарбонату поміщають у мірну колбу місткістю 100 см³, розчиняють дистильованою водою, доводять об'єм до мітки. Розчин розливають у пробірки і стерилізують при (121±1)°С протягом (30±1) хв.
6.3 Приготування реактивів метиленового блакитного
6.3.1 Приготування базового спиртового розчину метиленового блакитного 10 г метиленового блакитного змішують з 100 см³ 96 %-ого етилового спирту. Розчин витримують у термостаті за температури (37±1)°С протягом (24±1) год, а потім фільтрують також при температурі (37±1)°С.
Термін зберігання базового розчину метиленового блакитного в термостаті при температурі (37±1)0С - не більше трьох місяців за умов герметичності.
6.3.2 Приготування робочого розчину метиленового блакитного
Базовий розчин поміщають у водяну баню при температурі (45±1)°С на (8±2) хв, перемішують до повного розчинення кристалів. Потім швидко охолоджують до температури (20±1)°С і 5,0 см³ цього розчину додають до 195 см³ дистильованої кип'яченої води. Суміш добре перемішують. Термін зберігання робочого розчину метиленового блакитного в термостаті при температурі (8-10)°С - не більше 7 діб.
6.3.3 Приготування робочого розчину метиленового блакитного для фарбування препаратів
До 30 см³ базового спиртового розчину метиленового блакитного додати 100 см³ дистильованої води та 1 см³ розчину гідроокису калію з масовою концентрацією 10 г/см³.
6.4 Приготування суміші антибіотиків ННПЛ (розчин налідиксової кислоти, неоміцину, паромоміцину, літію хлористого).
Розчиняють (0,03±0,001) г налідиксової кислоти, (0,2±0,05) г неоміцину, (0,25±0,05) г паромоміцину та (6,0±0,1) г літію хлористого у (100±1) см³, стерилізують холодною стерилізацією і зберігають при температурі (4±1)°С до застосування. (Суміші антибіотиків ННПЛ рекомендується Міжнародною молочною федерацією).
6.5 Модифіковане печінкове середовище Блаурокка
0,5 кг свіжої яловичої печінки очистити від плівок і протоків, подрібнити, залити 1 дм³ дистильованої води і кип'ятити протягом 1,5-2 год. Відвар профільтрувати, довести до 1 дм3. Додати на 1 дм³: натрію хлориду - 5,0 г, пептону - 10,0 г; встановити активну кислотність рН (7,15±0,5) за допомогою 10 %-ого розчину гідроокису натрію. Кип'ятити 10 хв. Стерилізувати при (80±2)°С (30±1) хв. Наступної доби печінковий бульйон декантувати, додати дистильовану воду до 1 дм³. Внести на 1 дм³ бульйону: глюкози - 5,0 г, агар-агару - 0,8 г, цистеїну - 0,3 г. Кип'ятити 10 хв, довести рН до (7,7±0,1) хв. Розлити у пробірки по 10 см³ і стерилізувати при (121±1)°С протягом (15±1) хв або (20±1) хв при (112±1)°С .
Середовище перевіряють на стерильність шляхом інкубації при температурі (37±1)°С протягом двох діб.
Стерильне середовище Блаурокка зберігають не більше одного місяця при температурі (20±2)°С і не більше двох місяців при температурі (4±2)°С.
Ростові якості середовища Блаурокка контролюють внесенням ліофілізованої біомаси біфідобактерій.
Рекомендується використовувати середовище Блаурокка промислового виробництва.
Увага! Приготування кукурудзяно-лактозного та молочно-гідролізатного середовища в лабораторних умовах досить складне, всі компоненти повинні бути гарантованої якості.
6.6 Кукурудзяно-лактозне середовище (агаризоване)
В невеликій кількості дистильованої води розплавляють агар в кількості 2,5 г на 1 дм³ середовища. До решти дистильованої води додають 10 г пептону, 40 см³ водного розчину кукурудзяного екстракту, який розведений 1:6,6 г натрію лимонно-кислого тризаміщеного, 0,12 г магнію сірчанокислого, 2 г калію фосфорнокислого двозаміщеного. Суміш нагрівають до температури (80±2)°С, після чого змішують з розплавленим агаром, додають 10,0 г лактози і 0,15 г цистеїну солянокислого або 0,15 г аскорбінової кислоти. Попередньо цистеїн розчиняють у невеликій кількості дистильованої води, в якій встановлюють рН (8,45±0,5) за допомогою 10%-ого розчину гідроокису натрію і нагрівають на водяній бані до повного розчинення. У суміш до потрібного об'єму (1 дм³) доливають гарячу дистильовану воду і встановлюють рН (7,05±0,5) за допомогою 40 %-ого розчину гідроокису натрію.
Середовище розливають в пробірки високими стовпчиками по 10 см³ і стерилізують при (112±1)°С протягом (30±1) хв.
6.7 Молочно-гідролізатне середовище.
6.7.1 Відновлене (10%) сухе знежирене молоко об'ємом 1 дм³ кип'ятять, охолоджують, встановлюють значення активної кислотності (7,9± 0,1) од. рН за допомогою 40%-ого розчину гідроокису натрію, додають 8 см³ хлороформу, густиною 1,47 та (2,6±0,1) см³ панкреатину, гідролізують протягом 48 год. при (55±1)°С, фільтрують і розводять водопровідною водою у співвідношенні 1:1, встановлюють рН на рівні (7,3±0,1) та стерилізують при 121°С протягом 15 хв. У невеликій кількості одержаного гідролізованого бульйону розчиняють на водяній бані агар із розрахунку (17±2) г на 1 дм³. До решти бульйону додають (20±1) г пептону та (3,5±0,5) г хлористого натрію. Суміш нагрівають до температури (80±2)°С, після чого з'єднують із розплавленим агаром. Встановлюють значення активної кислотності (7,5± 0,1) од. рН, кип'ятять 15 хв., відстоюють, зливають, не фільтруючи, доливають гарячою дистильованою водою до 1 дм³ і додають (10±0,5) г лактози та (0,15±0,05) г цистеїну солянокислого. Середовище розливають по 10 см³ у стерильні пробірки і стерилізують при 112°С протягом 30 хв.
Також допускається застосування сухого поживного середовища, яке виробляється в Росії (ТУ 9291-094-04610209-2000). Визначення вмісту біфідобактерій з використанням цього середовища здійснюється наступним чином.
6.7.2 Приготування робочого середовища: (50±5) г сухого середовища вносять у (1±0,05) см³ холодної води (можливе використання дистильованої або питної води). Суміш ретельно перемішують, нагрівають, кип'ятять 3 - 5 хв. Перевіряють активну кислотність і при необхідності доводять її 20-30%-им розчином гідроокису натрію або 20%-им розчином молочної кислоти до рН (7,4±0,2) од. Середовище розливають в пробірки по 20 см³, закривають ватними пробками і стерилізують при температурі (37±1)°С протягом (15±1) хв.
6.7.3 Використання робочого середовища: безпосередньо перед застосуванням пробірки з середовищем нагрівають на водяній бані до кипіння і витримують протягом (25±5) хв. Після чого середовище швидко охолоджують до температури (40±45)°С. При посіві уникають струшування і потрапляння всередину стовпчика середовища повітря з піпетки. При визначенні біфідобактерій в продуктах зі змішаною мікрофлорою рекомендується до середовища додавати розчин неоміцину.
Приготування розчину неоміцину: (0,5±0,01) г неоміцину розчиняють в (500±1) см³ стерильної води. При проведенні аналізу, в готове середовище перед розплавленням, вносять 0,1 см³ розчину неоміцину з розрахунку на 20 см³ середовища. Допускається додавання водних розчинів антибіотиків до розплавленого та охолодженого середовища.
Увага! Використання неоміцину не завжди забезпечує повне пригнічення супутньої мікрофлори, тому рекомендується застосовувати суміш ННПЛ (п.6.4).
6.8 Приготування поживних середовищ для ідентифікації біфідобактерій.
Використовують сухе поживне середовище МРС (середовище Mann-Rogosa-Scardovi), у яке додають 1 % від загального об?єму відповідного вуглеводу, стерилізують текучою парою або при (115±1)°С 15 - 20 хв.
Дозволяється використовувати інші сухі поживні середовища дозволені до використання в Україні.
7. Визначення кількості біфідобактерій 7.1 Методика заснована на здатності біфідобактерій рости у поживних середовищах, які розлиті високим стовпчиком у пробірках, при температурі (38±1)оС і утворювати у них через 24-72 години колонії з типовими для біфідобактерій морфологічними характеристиками. 7.2 Підготування проб до аналізу 7.2.1 Розкриття пакетів необхідно проводити в асептичних умовах. 7.2.2 Кожну відібрану пробу (пакування) аналізують окремо. З кожного пакету після ретельного перемішування піпеткою відбирається 10 см3 кисломолочного продукту, які поміщають у стерильний посуд і потім нейтралізують. Для цього до 10 см3 взятого продукту в стерильний посуд для аналізу додають 1,0 см3 стерильного розчину натрію гідрокарбонату з масовою концентрацією 100 г/дм3; суміш ретельно перемішують, застосовуючи необхідні стерильні пристосування або шуттель-апарат. рН встановлюють на рН-метрі. 7.2.3 До нейтралізованого зразка продукту додають фізіологічний розчин до загального об'єму проби 100 см3, після чого суміш знов ретельно перемішують. Таким чином, отримують перше розведення (1х10-1). Піпетку промивають 10-12 раз отриманою сумішшю до верхніх поділок. 7.2.4 Подальші десятикратні розведення продукту готують наступним чином: додають до 9 см3 фізіологічного розчину по 1 см3 продукту попереднього розведення . При цьому суміш у кожному випадку ретельно перемішують. Для приготування окремого розведення беруть нову стерильну піпетку. 7.3 Проведення дослідження Готують 2 ряди поживних середовищ, кожен з яких по 5 пробірок, що містять середовище Блаурокк або інше середовище у кількості 10 см3 для висіву з них відповідних розведень взятого до досліду продукту. Перед вживанням середовище потрібно розігріти на киплячій водяній бані для зниження в ньому вмісту розчиненого кисню. При використанні агаризованих поживних середовищ перед проведенням аналізу їх слід розігріти у киплячій водяній бані до повного розплавлення агару. Після цього пробірки охолоджують до 47±1оС, додають суміш антибіотиків із розрахунку 0,1 см3 на 10 см3 середовища. В момент використання температура поживних середовищ повинна бути (38±1)оС. Внесення посівного матеріалу в середовище здійснюють починаючи з останнього розведення: в останню пробірку кожного з двох рядів середовища вносять по 1 см3 продукту 1х10-8, 1х10-7, 1х10-6, 1х10-5, 1х10-4. Таким чином, перша пробірка кожного ряду буде містити розведення продукту 1х10-4, а остання - 1х10-8. Після внесення розведення продукту в середовище вміст пробірки ретельно перемішують (наприклад, круговими рухами руки або за допомогою шуттель-апарату). 7.4 Інкубація Пробірки з посівами зразків продукту витримують в термостаті при температурі (37±1)0С протягом (72±1) год, посіви переглядають через 24 - 48 год. Допускається попередній підрахунк через (48±1) год з подальшим остаточним підрахунком через (72±1) год.