МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Н А К А З
№ 321 від 21.08.2002
м. Київ |
Про затвердження інструкції з лабораторної діагностики сибірки у людей, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля
Щороку в Україні від людей та з об'єктів довкілля виділяються культури сибірки. Тільки за останні три роки від людей було виділено 14, а з об'єктів довкілля 9 штамів Bacillus anthracis.
Обсяг лабораторних досліджень на сибірку в 2001 році зріс у порівнянні з минулими роками майже на 20%. Збільшення обсягу досліджень, в першу чергу з об'єктів довкілля, пов'язано з терористичними актами використання збудника сибірки і випадками зараження ним людей в деяких країнах світу та з метою попередження виникнення надзвичайних ситуацій в нашій країні. Проби "невідомих речовин" досліджувались у всіх областях, окрім Київської. Найбільше цих досліджень проведено в Донецькій, Дніпропетровській, Херсонській, Волинській, Полтавській, Черкаській, Кіровоградській областях, містах Києві та Севастополі.
Надзвичайна ситуація 2001 року ще раз підтвердила необхідність постійної готовності до проведення лабораторних досліджень на особливо небезпечні інфекції, в т.ч. сибірки.
З метою удосконалення лабораторної діагностики сибірки НАКАЗУЮ:
1. Затвердити Інструкцію з лабораторної діагностики сибірки у людей, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля (додається).
2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської державних адміністрацій, Головного управління охорони здоров'я Київської міської державної адміністрації, головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України, директору Українського науково-дослідного протичумного інституту, начальнику Кримської протичумної станції:
2.1. Забезпечити своєчасну діагностику сибірки в осіб, з підозрою на це захворювання, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля відповідно до Інструкції.
2.2. Вжити заходів щодо забезпечення постійної готовності установ до проведення таких досліджень.
3. Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя:
3.1. Забезпечити лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій необхідними діагностичними поживними середовищами, імунобіологічними препаратами, реактивами, антибіотиками та лабораторними тваринами.
3.2. Встановити жорсткий контроль за виконанням вимог протиепідемічного режиму в підрозділах, де проводиться робота з матеріалом, підозрілим на контамінацію збудником сибірки, та надійну систему охорони їх.
3.3. Направляти виділені штами збудника сибірки для ідентифікації та подальшого вивчення до лабораторії особливо небезпечних інфекцій Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України - референс лабораторії з діагностики зооантропонозних інфекцій.
4. Центральній санітарно-епідеміологічній станції МОЗ України (Некрасова Л.С.)
4.1. Надавати установам та закладам охорони здоров'я, державної санітарно-епідеміологічної служби організаційно-методичну і практичну допомогу з питань лабораторної діагностики сибірки.
4.2. Забезпечити ідентифікацію та вивчення штамів збудника сибірки, виділених від хворих та з об'єктів довкілля.
5. Вважати такими, що втратили чинність "Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения в объектах внешней среды", Москва, 1986.
6. Контроль за виконанням наказу покласти на начальника Головного санепідуправління МОЗ України Бережного С.П.
Перший заступник Державного
секретаря, Головний державний
санітарний лікар України |
О.О.Бобильова |
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Міністерства
охорони здоров'я України
21.08.2002 № 321
ІНСТРУКЦІЯ
З ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ СИБІРКИ У ЛЮДЕЙ, В СИРОВИНІ ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ТА ОБ'ЄКТАХ ДОВКІЛЛЯ
1. Загальні положення
Лабораторні дослідження на сибірку від людей та з об'єктів довкілля здійснюються на базі лабораторій відділів особливо небезпечних інфекцій санепідстанцій, в протичумних установах, які мають дозвіл на роботу із збудниками II групи патогенності.
Дослідження на сибірку включає мікроскопію мазків з досліджуваного матеріалу, посіви на поживні середовища, постановку біопроби, при необхідності, реакцію преципітації, ідентифікацію виділених культур.
Збудник сибірки - Вас. anthracis, відноситься до роду Bacillus, сімейства Bacillacea, - нерухома велика грампозитивна паличка, довжиною 5-10 мк, товщиною 1-1,5 мк, оптимум росту 35-37 град. С, рН 7,2-7,6.
При культивуванні на поживних середовищах, а також в трупному матеріалі утворює спори. Спори овоїдної форми, містяться в центрі мікробної клітини, не перевищуючи її поперечника. В організмі людини, сприйнятливих тварин, свіжих трупах та крові загиблих тварин, а також на поживних середовищах з додаванням сироватки або крові утворює капсулу. Здатність утворювати капсулу і специфічний екзотоксин обумовлює патогенність збудника.
Збудник сибірки невибагливий до поживних середовищ, дає пишний ріст на МПБ і МПА. В бульйоні ріст у вигляді крупних пластівців, які через добу осідають на дно пробірки нагадуючи "жмуток вати".
На агарі ріст бацил сибірки можна помітити під малим збільшенням мікроскопа вже через 4 години після вирощування в термостаті. Через 18-20 годин з'являються добре розвинені колонії збудника сибірки - великі, шорсткі, матові, білувато-сірі, по зовнішньому виду нагадують пухкий таючий сніг. Типовим для молодих колоній сибірки є наявність тонких відростків - "вусиків". Під малим збільшенням мікроскопа (у 10-60 разів) колонії мають вид локонів, що складаються зі сплетень довгих ниток мікробів і отримали назву "голови медузи", "левової гриви".
Збудник сибірки може розкладати з утворюванням кислоти без газу глюкозу, мальтозу, сахарозу. При посіві на молоко воно зсідається повільно, через 2-4 доби і надалі також повільно пептонізується. Лакмусове молоко червоніє за рахунок утворення кислоти.
У збудника сибірки встановлена наявність каталази і лецитінази, немає уреазної та фосфотазної активності, він чутливий до пеніциліну, лізується специфічними бактеріофагами, патогенний для лабораторних тварин.
2. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА СИБІРКИ У ЛЮДЕЙ
2.1. Відбір і пересилка матеріалу на дослідження
Матеріал забирають:
- від хворого - медичний персонал лікувально-профілактичних закладів, негайно після виявлення і до початку лікування антибіотиками;
- при обстеженні вогнищ - помічники епідеміологів;
- трупний матеріал - патологоанатоми і судмедексперти в спеціалізованих закладах.
При шкірній формі захворювання дослідженню підлягає вміст везикул, карбункулів, виразка або відторгнутий струп. Перед відбором матеріалу у хворого (бажано до початку лікування) шкіра навколо ураженого місця і поверхня карбункула обережно протираються спиртом.
При підозрі на легеневу форму сибірки досліджується мокрота, на кишкову форму - випорожнення хворого або сеча (1-2 л).
У випадках септичної форми захворювання беруть кров із вени, бажано в період гарячки. Кров в кількості 1-2 мл засівають на рідкі та 1-2 краплі на щільні поживні середовища, а також роблять два тонких мазки на предметних скельцях.
У померлих беруть частини уражених органів, тканин, кров, селезінку у встановленому порядку щодо проведення патолого-анатомічних та серцево-медичних експертних досліджень.
2.2. Направлення матеріалу на дослідження
Патологічний матеріал, що підлягає дослідженню, вміщують у стерильний посуд (пробірки, банки). Висушені мазки вміщують у чашки Петрі, які обгортають щільним папером. На упаковці роблять напис "Мазок не фіксований!".
Посуд із патологічним матеріалом вміщують у вологонепроникливу тару, обв'язують, пломбують або опечатують, роблять надпис "Верх, обережно" і направляють в лабораторію спеціальним посильним.
На супровідній етикетці до матеріалу вказують прізвище, ім'я, по батькові хворого (померлого), дата захворювання, місце і час забору матеріалу, його назву і можливий діагноз.
2.3. Порядок проведення дослідження
Лабораторне дослідження матеріалу включає:
- мікроскопічне дослідження (перегляд мазків і ІФМ);
- бактеріологічне дослідження (посіви на поживні середовища, виділення чистої культури);
- біологічне дослідження (на лабораторних тваринах);
- серологічне дослідження (реакція преципітації і РПГА);
- ідентифікацію виділених культур.
У випадку доставки матеріалу, що загнив, його досліджують тільки в реакції преципітації.
2.4. Мікроскопічне (попереднє) дослідження
2.4.1. З доставленого матеріалу роблять мазки, фіксують етиловим спиртом з добавленням 3% перекису водню (додаток п.1), фарбують по Граму і на капсулу по Ребігеру, Міхіну, Ольту або Романовському-Гимзі; а також обробляють люмінесцентними сироватками - по методу флуоресцуючих антитіл.
2.4.2. В мазках, пофарбованих по Граму, Вас. anthracis - прямі грампозитивні палички, які розташовуються короткими ланцюжками або попарно, кінці їх звернені один до одного, різко обрубані, вільні кінці закруглені. В окремих випадках форма збудників сибірки може бути нехарактерною (короткі товсті або зігнуті, іноді зернисті палички зі здуттям посередині або на кінці, можлива наявність "тіней" мікробів).
В мазках із свіжого патологічного матеріалу, пофарбованих спеціальними методами, палички сибірки оточені капсулою. Існують штами сибірки, які не утворюють капсулу і є авірулентними. Виділення та ідентифікація таких культур наведена в додатку до лабораторної діагностики. При фарбуванні мазків із несвіжого патологічного матеріалу мікроби можуть бути трохи збільшені, кінці закруглені, морфологічна структура бацил порушена, вони наче поїдені, іноді залишаються "тіні", а від капсул можуть залишатися обривки, які дуже слабо забарвлюються.
2.4.3. Обробку препаратів люмінесцентними сироватками проводять відповідно до настанови по їх застосуванню.
Виявлення в мазку специфічного свічіння дозволяє підозрювати наявність у досліджуваній пробі збудника сибірки.
2.4.4. За результатами мікроскопічного дослідження негайно видається попередня відповідь.
2.5. Бактеріологічне дослідження (посіви на поживні середовища)
2.5.1. Посіви з досліджуваного матеріалу проводять на диференційно-діагностичне середовище з 0,01% фенолфталеїнфосфату натрію або м'ясо-пептонний агар (МПА), м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), або бульйон і агар Хотінгера (рН 7,4 +- 0,2).
Посіви інкубують 18-24 год. при температурі 37 +-1 град. С, а при відсутності росту, витримують при цій же температурі ще 48 год.
З свіжого патологічного матеріалу можна одночасно робити висіви на систему диск-преципітації (додаток 2). Посів проводять пастерівською піпеткою в МПБ, що знаходиться над шаром агарового гелю. Не слід вносити в середовище багато крові або великі шматочки кровонаповнених органів, тому що це затруднює виявлення специфічного диску преципітації внаслідок фарбування гелю.
Постановка та облік диск-преципітації в п. 3.5.
2.5.2. На щільних поживних середовищах збудник сибірки утворює плоскі матово-сірі шорсткуваті (R-форма) колонії. Центр колоній іноді затемнений, периферія торочкувата з локоноподібними паростками. Зустрічаються колонії з менш вираженою шорсткістю і без паростків, вони також підлягають подальшій ідентифікації. Під малим збільшенням мікроскопа колонії мають вид локонів.
Культури, що виросли на диференційно-діагностичному середовищі обробляють парами аміаку і для подальшого дослідження відбирають тільки безбарвні колонії.
МПБ після добового росту збудників сибірки залишається прозорим, на дні утворюється пухкий осад у вигляді жмутка вати. При струшуванні пробірки бульйон не мутніє, осад розбивається на дрібні пластівці. В окремих випадках у МПБ може бути дифузний ріст культури (легке помутніння), при струшуванні утворюються муарові хвилі.
2.5.3. З бульйонної культури роблять мазки, фарбують по Граму і досліджують під мікроскопом. У мазках з типової бульйонної культури збудника сибірки палички виявляються у вигляді ланцюжків, із бульйонної культури з дифузним ростом - окремі або парно розташовані палички.
2.5.4. При одержанні змішаної культури, виділення чистої культури збудника сибірки проводять звичайними методами (дрібний розсів на щільні поживні середовища в чашки Петрі, відсів окремих колоній, зараження білих мишей).
2.5.5. З шорсткуватих колоній, що виросли на МПА, а також із безбарвних колоній на диференційно-діагностичному середовищі роблять мазки, пересівають у МПБ і на МПА для подальшої їх ідентифікації.
При відсутності росту посіви витримують 5 діб.
Досліджувані культури замість МПБ можна пересівати в систему для постановки реакції диск-преципітації. У цьому випадку подальшу роботу проводять тільки з культурами, що дали позитивні або нечіткі результати.
2.6. Біологічне дослідження
2.6.1. Зараження лабораторних тварин досліджуваним матеріалом є обов'язковим і проводиться в день надходження матеріалу одночасно з посівом на поживні середовища. Досліджуваний матеріал, розтертий у невеликому об'ємі 0,9%-ного розчину натрію хлориду, вводять двом білим мишам у дозі 0,2-0,5 мл під шкіру спини ближче до кореня хвоста або двом морським свинкам у дозі 0,5-1,0 мл підшкірно в області внутрішньої поверхні стегна. При дослідженні крові ("чистого" матеріалу) використовується внурішньочеревне зараження. Загибель заражених білих мишей наступає через 1-2 доби з появленням набряку і загального сепсису, морські свинки через 2-3 доби з тими ж проявами. Іноді загибель відбувається пізніше.
2.6.2. Тварин, які загинули, розтинають, роблять мазки і посіви з крові серця, селезінки, печінки, інфільтрату на місці ін'єкції досліджуваного матеріалу.
В мазках з крові, серця, селезінки бактеріоскопічно встановлюють наявність збудників сибірки у вигляді коротких ланцюжків, паличок, оточених капсулою. Посіви з органів та крові дають на МПА колонії R-форми, а на бульйоні - ріст із утворенням пластівців на дні пробірки (жмуток вати).
При розтині лабораторних тварин, що загинули від сибірки, виявляється типова патолого-анатомічна картина.
При підшкірному зараженні - різкий драглеподібний набряк підшкірної клітчатки, ексудат в черевній та грудній порожнинах, багаточисельні геморагії, збільшення лімфатичних вузлів. Печінка та селезінка збільшені, кров, як правило, не згортається. В легенях - пневмонічні ділянки. У випадках дуже швидкої смерті тварин, патолога-анатомічні зміни, особливо набряк, не встигають розвинутись і виражені не так різко.
Необхідно враховувати, що при дослідженні матеріалу (особливо матеріалу від тварин) лабораторні тварини можуть загинути від супутньої патогенної мікрофлори, частіше від пастерел. У цих випадках проводять повторне зараження лабораторних тварин виділеними підозрілими на збудник сибірки культурами.
2.6.3. У випадках, коли чиста культура збудника з посівів матеріалу на поживному середовищі отримана раніше, ніж наступить смерть заражених тварин, додатково заражають добовою бульйонною культурою двох лабораторних тварин в дозах, зазначених вище.
2.6.4. Спостереження за лабораторними тваринами, зараженими патологічним матеріалом або культурою, ведуть протягом 10 діб. Розтин тварин проводять тільки в разі їх загибелі.
2.7. Серологічні дослідження
2.7.1. Реакція преципітації. Ця реакція не застосовується для прижиттєвого діагнозу. Перед постановкою реакції свіжий патологічний матеріал витримують у термостаті протягом 18-20 год. Несвіжий патологічний матеріал екстрагують без витримування в термостаті.
Екстрагування проводять двома способами: гарячим і холодним. При цьому потрібно враховувати, що екстракти, отримані гарячим способом, бідніші преципітиногенами.
Гарячий спосіб екстрагування: шматочки досліджуваного патологічного матеріалу (1-2 г) вміщують в пробірку або колбу, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду в співвідношенні 1:10 і кип'ятять протягом 30-40 хв. на водяній бані.
Холодний спосіб екстрагування: шматочки патологічного матеріалу (1-2 г) розтирають в ступці з піском, переносять в колбу або баночку, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду (з додаванням 0,3% кристалічного фенолу) в співвідношенні 1:10 і залишають на 16-18 год. при температурі (20 +- 2) град. С.
Отримані екстракти фільтрують через азбестову вату або фільтрувальний папір до прозорості, перші краплі фільтрату видаляють.
Реакцію ставлять шляхом нашаровування або підшаровування.
При нашаровуванні в уленгутівську пробірку наливають 0,2 - 0,3 мл прозорої преципітуючої сибіркової сироватки і обережно нашаровують рівну кількість екстракту так, щоб між компонентами була чітко виражена межа (тонка пряма лінія).
При підшаровуванні в уленгутівську пробірку спочатку вносять 0,2-0,3 мл екстракту, потім під нього обережно пастерівською піпеткою підшаровують рівну кількість преципітуючої сироватки.
Якщо при з'єднанні компонентів чітко виражена межа між ними відсутня, реакцію ставлять повторно.
Одночасно ставлять контроль преципітуючої сибіркової сироватки з стандартним сибірковим антигеном. Через 1-2 хв. після з'єднання компонентів, з'являється характерне кільце (реакція позитивна) та негативний контроль сироватки з неспецифічним антигеном.
Реакцію вважають позитивною, якщо через 1-2 хв. і не пізніше, ніж через 15 хв. на межі між компонентами з'явиться тонке білувате кільце.
При негативному результаті реакції преципітації з екстрактом, отриманим гарячим способом, реакцію ставлять повторно з екстрактом, отриманим холодним способом.
Е.Шляхов, С.Шварц та ін. запропонували для діагностики сибірки використовувати дифузну преципітацію в агаровому гелі з екстрактом із струпа карбункула (1964). Агар, що використовується для реакції преципітації, розливають в чашки Петрі. По охолодженні в ньому вирізають два ряди лунок, дно яких заливають тонким шаром того ж агару. Відстань між лунками - 6 мм. В один ряд лунок наливають по 0,2 мл сибіркової сироватки, в другий - екстракт струпа - цільний і розведений в 2-4-8-16 разів в тому ж об'ємі. Для контролю в одну з лунок другого ряду вносять сибірковий антиген. Чашки витримують при кімнатній температурі протягом 48 годин. При позитивному результаті між лунками з сироваткою і екстрактом із струпа з'являється лінія преципітації, що відповідна до лінії в контролі. При дослідженні струпа реакція специфічна.
2.7.3. Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА)
Реакція використовується для виявлення та ідентифікації спорових та вегетативних форм збудника сибірки в підозрілих культурах, об'єктах довкілля та матеріалі від хворих людей і тварин. Постановка та облік результатів проводиться відповідно до настанови по застосуванню еритроцитарного діагостикума.
2.8. Ідентифікація збудника сибірки
2.8.1. Ідентифікацію збудника сибірки проводять за такими ознаками:
- морфологія мікроба, включаючи наявність капсул в мазках із досліджуваного матеріалу або органів загиблих лабораторних тварин;
культуральні властивості;
чутливість до пеніциліну; *
чутливість до специфічних фагів;
патогенність для лабораторних тварин
_______________
* На території України мають місце випадки виділення штамів, нечутливих до пеніциліну
2.8.2. Чутливість до пеніциліну (тест "перлинового намиста")
Агар, що містить 0,5 і 0,05 одиниць (од.) пеніциліну в 1 мл середовища (додаток 5), і без нього, розливають у чашки Петрі; після застигання пробіркою з рівними краями надсікають агар або вирізують пластинки (1,5 х 1,5 см), які переносять на предметні скельця і вміщують у чашки Петрі. На кожну пластинку бактеріологічною петлею наносять 3-годинну бульйонну культуру. Чашки закривають кришками і вміщують у термостат. Через 1-3 год. посіви переглядають під мікроскопом з сухою (об'єктив х 40) і імерсійною системами. Перед переглядом зону росту накривають покривним склом. Мікроби сибірки на МПА з пеніциліном приймають кулькоподібні форми, а ланцюжки мають вигляд "перлинового намиста". Спороутворюючі сапрофітні аеробні мікроби в аналогічних умовах виростають у вигляді звичайних форм. На агарі без пеніциліну збудник сибірки утворює довгі ланцюжки, що складаються з типових паличок. При негативному результаті мікроскопії інкубацію посівів продовжують до 6 год., після чого досліджують повторно і роблять заключний облік тесту.
Модифікація тесту "перлинового намиста" з використанням 0,3% агару Хотінгера (Н.П.Буравцева, В.О.Ярощук)
До розплавленого і охолодженого до 43 град. С 0,3% агару Хотінгера рН (7,3-7,6) додають 20-40% інактивованої при 56 град. С кінської сироватки. Виготовлене середовище стерильно розливають по 4,5 мл в пробірки і засівають по 0,1 мл суспензії спорової або вегетативної форми культури сибірки, що містить від 100 тис. мікробних клітин по стандарту мутності.
Пробірки з посівами інкубують на протязі 4 годин при 37 град. С, потім додають пеніцилін із розрахунку 0,5-0,05 од. на 1 мл середовища. Пробірки ставлять в термостат при 37 град. С на підрощування на 1,5-2 години, після чого роблять мазки, висушують на повітрі і фіксують в етиловому 96 % спирті з доданням 3% перекису водню на протязі 30 хвилин. Після фіксації мазки висушують на повітрі, фарбують метиленовою синькою або люмінесцентними сироватками і мікроскопують.
Модифікація тесту "перлинового намиста" з використанням МПБ.
Використовується МПБ з додаванням 20% інактивованої кінської сироватки. На 100 мл МПБ вноситься 0,5 мл розчину, що вміщує 100 од. пеніциліну в 1 мл (отримуємо в 1 мл МПБ 0,5 од. пеніциліну). Для отримання в 1 мл МПБ 0,05 од. пеніциліну в 100 мл МПБ вносять 0,5 мл пеніциліну, що містить 10 од/мл.
В 3 мл МПБ з інактивованою кінською сироваткою та розчинами пеніциліну (0,5 та 0,05 од/мл) додається по 2-3 краплі 3-годинної або добової бульйонної культури і інкубується напротязі 3 годин при температурі 37 град. С. Готують мазки, матеріал беруть з дна пробірки, мазки фіксують рідиною Карнуа (6 частин етилового спирту, 3 частини хлороформу, 1 частина крижаної оцтової кислоти) до її випарювання, фарбують метиленовою синькою 20-30 секунд і мікроскопують.
Bacillus anthracis знаходиться в мазках у вигляді куликоподібних форм.
B. Cereus та інші сапрофітні бацили на середовищі з пеніциліном ростуть звичайно. У випадку негативного результату інкубацію посівів слід продовжити до 6 годин.
2.8.3. Чутливість до специфічних фагів
Чутливість до фагів визначають одним з таких методів: стікаючої краплі, пробірочним або мікрометодом з використанням сибіркового бактеріофагу К, ВІЕВ у відповідності з настановами по застосуванню. Для тесту фаготипування використовують збудник сибірки тільки у вегетативній формі.
2.8.4. Патогенність для лабораторних тварин
Патогенність підтверджується смертю хоча б однієї з двох лабораторних тварин, заражених досліджуваним матеріалом або отриманою культурою, з подальшим виділенням з його органів типової культури збудника сибірки.
2.8.5. Додаткові тести ідентифікації.
Відсутність гемолізу визначається при посіві досліджуваної культури на МПА з 5-10% дефібрінованої крові барана. Посіви інкубують при 37 град. С на протязі 18-20 годин і проводять облік.
Відсутність лецитіназної активності визначається при посіві досліджуваної культури на рідке яєчне середовище. Середовище виготовляють шляхом змішування однієї частини курячого жовтка, що стерильно забирається, з двома частинами стерильного 0,85% розчину хлориду натрію. Середовище розливають в пробірки, засівають петлею досліджувану культуру і інкубують при 37 град. С. Збудник сибірки, як правило, жовток не згортає на протязі декількох діб інкубації.
Відсутність фосфотазної активності визначається на такому середовищі. До розплавленого і охолодженого до 45 град. С МПА додають 0.001% фенолфталеїнфосфату натрію. Середовище розливається в чашки Петрі і, після підсушування, на поверхню штрихом засівається досліджувана культура. Через 18-24 години на поверхню агару додається декілька краплин нашатирного спирту. Колонії сибірки, що не утворюють фосфотази, залишаються безбарвними, а колонії спороутворюючих сапрофітів забарвлюються від рожевого до червоного кольору.
2.8.6. Виділену культуру відносять до Вас. anthracis:
- при наявності характерних морфологічних і культуральних властивостей, капсул у мазках із патологічного матеріалу або з органів загиблої тварини;
- при відсутності капсул, але наявності інших характерних морфологічних і культуральних властивостей, чутливості до сибіркового фагу і пеніциліну.
2.9. Терміни дослідження:
- мікроскопічного - у день надходження матеріалу;
- бактеріологічного - до 3 діб;
- біологічного - до 10 діб.
3. ВИЯВЛЕННЯ ЗБУДНИКА СИБІРКИ В СИРОВИНІ ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ТА ОБ'ЄКТАХ ДОВКІЛЛЯ
3.1. Дослідження об'єктів довкілля і сировини тваринного походження проводять:
- при необхідності встановити або підтвердити джерело або фактор передачі інфекції;
- для виявлення обсіменіння збудником сибірки окремих об'єктів;
- з метою виявлення збудника сибірки в місцях старих скотомогильників при проведенні будівельних, меліоративних, гідротехнічних та інших робіт, пов'язаних з вибиранням і переміщенням грунту;
- для підтвердження результатів дослідження шкурок смушку, козеняти та ін. у випадках позитивної реакції преципітації.
- проведення внутрішнього лабораторного бактеріологічного контролю - змиви з лабораторного обладнання, інструментарію, відбір проб повітря в лабораторіях, де проводять дослідження на сибірку, змивів та ін.
3.2. Взяття матеріалу на дослідження
3.2.1. Відбір проб вовни. Для бактеріологічного дослідження беруть із різних місць не менше 5 зразків масою біля 2 г кожний (краще брати пучок забрудненої вовни). Якщо вовна упакована в паки, беруть не менше 10 зразків з різних місць кожної паки, а також пил, що зібрався всередині обшивки. Зразки від однієї паки об'єднують і упаковують разом.
3.2.2. Відбір проб шкіряно-хутряної сировини. Для дослідження беруть шматочки розміром 3 х 3 см з периферичних незагнилих і незацвілих шкурок поруч з місцями, звідки брали проби для контрольного дослідження. При наявності на внутрішній стороні шкурки синців або інфільтратів проби беруть і в цих місцях.
3.2.3. Відбір проб кормів. Концентровані корми (зерно, висівки, комбікорм) відбирають в залежності від умов їх зберігання.
При наявності незатарених кормів проби відбирають з розрахунку 1 проба масою не менше 100 г на 4 кв. м поверхні, але не менше 5 проб від кожного засіку, партії. Проби беруть як з поверхневих, так і з глибоких шарів кормів рівномірно по всій площі.
При наявності затарених кормів відбір проводять відповідно до такої таблиці:
------------------------------------------------------------------
|Кількість пакувальних одиниць| Від якої кількості пакувальних |
| | одиниць відбирають проби |
|-----------------------------+----------------------------------|
|До 10 |від кожної пакувальної одиниці |
|-----------------------------+----------------------------------|
|Від 11 до 100 |від 10 пакувальних одиниць |
|-----------------------------+----------------------------------|
|Від 101 і більше |Від 10 пакувальних одиниць і |
| |додатково по 3 від кожних 100 |
| |пакувальних одиниць |
------------------------------------------------------------------
Відбір проб проводять сухим стерильним щупом. Після взяття проб від кожного об'єкта (партії) щуп очищають і обпалюють вогнем паяльної лампи.
Проби грубих кормів (сіно, солома) беруть із різних місць скирти (стогу) за допомогою ножиць і пінцета з розрахунку 1 проба масою не менше 40 г на 4 кв. м площі скирти.
Зібрану зелену масу беруть, як і грубі корми, збільшивши масу проби до 100 г.
Коренеплоди (бульбоплоди) відбирають з розрахунку 1-3 штуки на 4 кв. м площі бурту, відсіку. З відібраних коренеплодів скальпелем у місцях, де є залишки землі, зрізають поверхневий шар, який використовують для дослідження.
Проби силосу, що зберігається в ямах (траншеях), відбирають як проби грунту, а вийнятого з траншей - як проби зеленої маси.
В лабораторію направляють середню пробу, яку складають з добре перемішаних проб даної партії, об'єму і т.п. Маса середньої проби не повинна перевищувати 500 г.
3.2.4. Відбір патологічного матеріалу від тварин
На дослідження направляють вухо, перев'язане в основі або мазки крові, отримані з надрізу вуха; від трупів свиней - шматки набряклої сполучної тканини і заглоточні підщелепні, а також інші лімфатичні вузли, в яких є характерні патолого-анатомічні зміни.
Вухо відрізають із тієї сторони, на якій лежить труп. Попередньо його туго перев'язують шпагатом в основі в двох місцях і відрізають між перев'язками. Місце відрізу вуха на трупі припікають.
Якщо підозра на сибірку виникла при розтині трупа тварини (крім трупів свиней), розтин припиняють і на дослідження направляють частину селезінки.
Відбір матеріалу від вимушено забитих тварин і його дослідження проводять відповідно до ДОСТ 21237-75 "М'ясо. Методи бактеріологічного аналізу" і діючими Правилами ветеринарного огляду забійних тварин і ветеринарно-санітарної експертизи м'яса і м'ясних продуктів.
3.2.5. Відбір проб грунту
Обстеженню підлягають ділянки, що підозрюються на зараження збудником сибірки. Площу, що досліджується, розбивають на квадратні ділянки зі стороною не більше 4 м. Грунтовим буром відбирають проби грунту масою 20-30 г кожна, по кутах і в центрі кожної ділянки.
Проби грунту з території, підозрюваної в поверхневому обсіменінні збудником сибірки, беруть на глибину до 15 см.
Перед взяттям проб на території скотомогильників верхній шар грунту на місці взяття проби знімають на 2-3 см і пробу беруть на глибині до двох метрів через кожні 25 см.
Вийнятий з глибини і не використаний для проб грунт з метою знезараження змішують з сухим хлорним вапном, що містить 25% активного хлору в співвідношенні 1 частина хлорного вапна на 3 частини грунту, злегка зволожують і скидають у шурф. Місце відбору проб дезінфікують розчином хлорного вапна, інструменти - вогнем паяльної лампи.
3.2.6. Відбір проб води
Проби води з природних і штучних водоймищ беруть з поверхні (на глибині 10-15 см) і біля дна за допомогою батометра або спеціально пристосованого бутлю. Об'єм кожної проби не менше 0,5 л, загальний об'єм не менше 1 л.
Крім того, беруть проби придонного осаду біля берега і досліджують їх як проби грунту.
3.2.7. Змиви з об'єктів довкілля роблять з площі 100 кв. см марлевим тампоном, змоченим стерильною водою.
Тампони вміщують в пробірки з 4-5 мл стерильної води або 0,9%-ного розчину натрію хлориду і закривають гумовим корком.
Кожну відібрану пробу вміщують в суху стерильну скляну банку і закривають стерильною кришкою, корком або пергаментом, можна використовувати поліетиленові мішечки, які зав'язують шпагатом. Проби води наливають в стерильні скляні пляшки і закривають стерильними гумовими корком. Проби нумерують (проби вовни - номером паки), упаковують у вологонепроникливу тару і направляють в лабораторію з посильним.
В направленні до проб вказують мету проведення дослідження, найменування матеріалу, його кількість, місце і дату відбору матеріалу. Для проб вовни і кормів додатково вказують їх походження, об'єм (масу) партії, вид упаковки і кількість пакувальних одиниць. При направленні до лабораторії кількох проб до супровідної прикладають опис, де вказують номери проб і місце відбору кожної проби.
3.2.8. Відбір і упаковку проб проводять з дотриманням правил особистої гігієни і загальноприйнятих в бактеріологічній практиці правил стерильного відбору матеріалу, не допускаючи розсіювання збудника як при відборі, так і транспортуванні проб.
3.3. Підготовка проб до дослідження
3.3.1. При підготовці проб до дослідження і подальшої обробки використовують тільки стерильні розчини, посуд, фільтри, інструменти.
3.3.2. Від кожної проби вовни відбирають найбільш забруднені частини, подрібнюють ножицями, разом із пилом вміщують в колбу і заливають 10-кратною (по масі) кількістю 0,9%-ного розчину натрію хлориду. Колбу закривають, ретельно струшують протягом 10-15 хв. і дають відстоятися. Змив фільтрують через 2-3 шари марлі для видалення грубих часток.
3.3.3. З різних місць проб шкурок беруть шматочки масою 1 г, вміщують в порцелянову ступку і заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду з таким розрахунком, щоб отримати 10-15 мл суспензії. Через деякий час (після достатнього розм'якшення матеріалу) шматочки подрібнюють ножицями і залишають при температурі 20 град. С ще на 2-3 год. Після цього проби добре розтирають в тій же рідині до отримання волокнистої мезги; мезгу видаляють, попередньо віджавши її товкачем на внутрішній бічній поверхні ступки.
3.3.4. Пробу кормів в кількості 50-100 г (грубі корми після подрібнення ножицями) вміщують в колбу і заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду з розрахунку отримання 15-20 мл змиву. Колбу закривають, ретельно струшують протягом 10-15 хв., дають відстоятися 5-8 хв., не допускаючи набухання кормів, і фільтрують через 2-3 шари марлі.
3.3.5. Проби грунту звільняють від коренів, камінчиків і ретельно перемішують. Від кожної проби беруть 50-70 г вміщують в колбу, заливають 0,9%-ним розчином натрію хлориду, дистильованою водою або 0,5%-ним розчином пірофосфату натрію з розрахунку отримання 15-20 мл змиву, добре струшують протягом 25 хв., дають відстоятися 5-8 хв. і фільтрують через 2-3 шари марлі.
3.3.6. Воду з мулистими частинками фільтрують через 2-3 шари марлі, чисту воду досліджують без попередньої підготовки.
3.3.7. Тампони, якими роблять змиви з об'єктів довкілля, віджимають об стінки пробірки і видаляють, а залишену рідину досліджують.
3.4. Методи збагачення і бактеріологічне дослідження
3.4.1. Змиви з вовни, кормів, грунту, підготовлені як вказано вище, а також проби води і змиви з об'єктів довкілля ділять на дві частини.
3.4.2. Одну частину прогрівають на водяній бані 80 хв. при 65 град. С і фільтрують через 1-2 мембранні фільтри № 3 у фільтрі Зейтца при невеликому вакуумі. Осад з кожного фільтру змивають 6-8 краплями 0,9%-ного розчину натрію хлориду і використовують для посіву.
Мембранні фільтри перед використанням стерилізують кип'ятінням в дистильованій воді два рази по 10 хв. зі зміною води, фільтр Зейтца - звичайним способом.
3.4.3. Другу частину змиву або проби без попереднього прогрівання фільтрують через мембранні фільтри і досліджують аналогічно прогрітій частині проби. Крім того, змивом з мембрани заражують двох білих мишей підшкірно в дозі 0,2-0,3 мл і спостерігають за ними 10 діб. З органів загиблих мишей роблять мазки, які фарбують по Граму і на капсулу, і посіви на МПА та МПБ.
3.4.4. Змиви з борошнистих кормів, які важко фільтруються через мембранні фільтри, центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв. Висіви роблять з поверхневого шару надосадової рідини і осаду.
3.4.5. При відсутності мембранних фільтрів прогріті і непрогріті змиви, а також проби води центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв., надосадову рідину видаляють, а з осаду роблять висів.
3.4.6. Суспензією з шкурок (п. 3.3.4.) заражають двох білих мишей, як вказано в п. 3.4.3.
Залишок суспензії центрифугують 15 хв. при 3000 об/хв., потім 2/3 надосадової рідини видаляють, рідину що залишилася з осадом прогрівають на водяній бані 30 хв. при 65 град. С. Після охолоджування осад використовують для посіву.
3.4.7. Матеріал, підготовлений для дослідження, висівають на 3-4 чашки Петрі з МПА або агаром Хотінгера і, при наявності, на диференційно-діагностичне середовище з 0,01% фенолфталеїнфосфатом натрію. Засіяні чашки інкубують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С протягом 18-24 годин.
3.4.8. Для ідентифікації з агару відбирають не менше 10 шорсткуватих колоній (при відсутності такої кількості - усі шорсткуваті колонії), які не змінили кольору після обробки парами аміаку.
3.4.9. З відібраних колоній роблять пересів на МПА і МПБ для подальшої ідентифікації (п.2.8), замість МПА пересів можна робити в систему для постановки диск-преципітації.
3.5. Постановка та облік реакції диск-преципітації
3.5.1. Посів роблять у рідке поживне середовище системи, не торкаючись гелю, із кожної колонії окремо або висівають суспензію, приготовлену з кількох колоній. Посіви витримують в термостаті при (37 +-1) град. С 16-20 годин.
3.5.2. Облік результатів проводять візуально через 16-20 год. інкубації посівів в термостаті і при негативному результаті - повторно через 3-4 год. додаткової інкубації.
3.5.З. Пробірки витягують із термостату і залишають на 10-15 хв. при температурі (20 +- 2) град. С. Переглядають в прохідному світлі на чорному фоні.
3.5.4. Збудник сибірки утворює в середній частині стовпчика агарового гелю тонку з чіткою межею білу лінію (диск) преципітації, яка зберігається протягом 4 днів.
3.5.5. Грунтові сапрофітні бацили, за винятком деяких штамів Bacillus, дають негативний результат (диск преципітації відсутній). Окремі штами Bacillus через 16-20 годин утворять в нижній частині агарового стовпчика на межі з преципітуючою сироваткою рихлу зону преципітації, яка не має чітких меж і значно товща, ніж диск преципітації, що утворюється збудником сибірки. Через 36-40 годин зона преципітації, утворена штамами Bacillus, розпушується і зливається з преципітуючою сироваткою.
3.5.6. Як контроль, при постановці реакції диск преципітації можна використовувати посіви з вакциною СТІ.
3.5.7. Культури, що дали позитивні результати по реакції диск-преципітації або нечіткі результати (рихле кільце), ідентифікують як зазначено в п. 2.7.
Культури, що дали негативний результат, подальшому дослідженню не підлягають.
3.6. Отримані чисті культури ідентифікують по тестам, визначеним в п.2.9
3.7. Методи виявлення капсулоутворення
3.7.1.Метод виявлення капсулоутворення in vitro.
Досліджувану культуру висівають в середовище ГКІ (додаток 2). Пробірки з посівами закривають стерильними гумовими корками і вміщують в термостат при (37 +-1) град. С. Через 30-120 хв. інкубації в окремих сибіркових клітинах починається капсулоутворення, а через 16-18 годин всі або більшість сибіркових клітин утворюють капсулу. Для виявлення капсулоутворення з посівів роблять мазки.
Мазки фіксують, фарбують на капсулу і вивчають під мікроскопом. При позитивному результаті в мазках виявляють палички та ланцюжки паличок, оточених капсулою.
3.7.2. Методи виявлення капсулоутворення in vivo (прискорена біологічна проба).
Досліджувану культуру в дозі 0,1-0,2 мл вводять внутрішньочеревно чотирьом білим мишам. Через 1-2 год. після зараження забивають по одній миші, розтинають, із перитонеального ексудату і органів роблять мазки-відбитки для дослідження на наявність капсульних паличок збудника сибірки. Двох білих мишей лишають під наглядом до природної смерті або на 10 днів, як при класичній біологічній пробі.
3.8. Визначення вірулентності культур збудника сибірки
Визначення вірулентності проводять на кролях масою 2-2,5 кг.
3.8.1. Для зараження готують спорову культуру досліджуваного штаму. Для цього добову бульйонну культуру висівають на одне з таких середовищ: МПА, агар Хотінгера, голодний пшеничний або гороховий агар. Посіви витримують 3-4 дні в термостаті при (37 +-1) град. С. Процес спороутворення контролюють шляхом підрахунку спор при мікроскопії роздавленої краплі або пофарбованих мазків.
3.8.2. Після утворення спор у 90-100% мікробів бактеріальну масу змивають фізіологічним розчином і визначають концентрацію спор по стандарту каламутності або шляхом посіву серійних розведень на МПА. З суспензії спор відомої концентрації готують три робочих розведення з вмістом 10 тис., 100 тис. і 1 млн. спор в 1 мл.
3.8.3. Для визначення вірулентності двом кролям вводять підшкірно в ділянці живота по 1 мл розведення з концентрацією 1 млн спор/мл.
3.8.4. Для визначення ступеню вірулентності кожним розведенням (п.3.8.2) у дозі 1 мл заражають підшкірно в ділянці живота двох кролів і спостерігають за ними протягом 10 діб.
Ступінь вірулентності Вас. anthracis визначають по дозі, що викликала смерть кролів:
- високо вірулентні штами викликають смерть кролів при введенні 10 тис. спор;
- помірно вірулентні - при введенні 100 тис. і 1 млн. спор;
- слабо вірулентні і авірулентні штами не викликають смерті кролів у зазначених дозах.
4. ПРОТИЕПІДЕМІЧНИЙ РЕЖИМ РОБОТИ
При проведенні досліджень на сибірку необхідно суворо додержуватись вимог протиепідемічного режиму роботи з матеріалом, зараженим або підозрілим на зараженість збудниками інфекційних захворювань I-II групи патогенності, відповідно до вимог Державних санітарних правил 9.9.5.03599 "Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп патогенності".
Виділені культури Вас. anthracis установи охорони здоров'я направляють в лабораторію особливо небезпечних інфекцій Центральної санепідстанції МОЗ України (референс лабораторія з зооантропонозних інфекцій), якій надане право давати остаточний висновок про належність штамів до виду Вас. anthracis, при цьому характер і обсяг протиепідемічних і протиепізоотичних заходів, до отримання висновків лабораторії, проводиться відповідно до діючих нормативних документів.
5. ВИДІЛЕННЯ ЗБУДНИКА СИБІРКИ З АТИПОВИМ КАПСУЛО-УТВОРЕННЯМ ТА ВІРУЛЕНТНІСТЮ
Методика виділення атипових по капсулоутворенню і вірулентності штамів збудника сибірки розроблена НДПЧІ Кавказу та Закавказзя (Б.І.Єременко, Н.П.Буравцева) і передбачає використання сухого селективного диференціально-діагностичного середовища та содового агару в атмосфері з підвищеним вмістом вуглекислого газу.
Типові вірулентні штами сибірки (І тип по класифікації Торна, 1960 р.) в атмосфері з підвищеним вмістом вуглекислого газу на поверхні содового агару утворюють гладкі слизові блискучі колонії в S-формі. Ці штами вірулентні для білих мишей, морських свинок і кролів. Крім таких штамів, є штами, що відносяться до атипових по капсулоутворенню і вірулентності. Штами II типу (вони рідко зустрічаються) утворюють капсулу незалежно від наявності СО2 в атмосфері і ростуть в S-формі, як на звичайних поживних середовищах, так і на содовому агарі. Ці штами мають знижену вірулентність і не викликають гибелі кролів (для білих мишей і морських свинок вірулентні).
Штами III типу не утворюють капсулу, авірулентні для експериментальних тварин, на поживних середовищах формують шорсткі матові сухі колонії в R-формі (такі колонії утворюють типові вірулентні штами сибірки I типу на звичайних поживних середовищах - МПА).
Атипові штами являють значний інтерес при вивченні епідеміології та епізоотології сибірки, мікробіології та екології збудника.
Виготовлення селективного диференціально-діагностичного середовища. Наважку сухого середовища для виділення та культивування сибірки (вказана на етикетці) розплавляють, помішуючи в 1 л дистильованої води на водяній бані, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають по пляшках і стерилізують в автоклаві при 121 град. С 30 хв. В охолоджене до 45-50 град. С середовище додають розчин фенолфталеїнфосфату натрію, який попередньо прогрівають при 65 град. С 20 хв., в кінцевій концентрації 0,01%. Після переміщування середовище розливають в чашки Петрі і підсушують на протязі 1,5-2 годин при відкритих кришках.
Виготовлення 1% содового агару. До розплавленого і охолодженого до 45-50 град. С агару Хотінгера додають 100 мл 10% розчину двовуглекислої соди (10 г соди в 100 мл дистильованої води). Об'єм агару доводять до 1 л і розливають в чашки Петрі. Содовий агар готують перед використанням і не зберігають.
Посів матеріалу на селективне диференційно-діагностичне середовище. Досліджуваний матеріал в об'ємі 0,1-0,2 мл наноситься на поверхню середовища, розлитого в чашки Петрі, ретельно розтирають і переносять шпателем на другу чашку, бажано використовувати не менше 3-х чашок. Посіви інкубують в термостаті при температурі 37 град. С на протязі 16-18 годин. Більша частина сапрофітної мікрофлори на селективному поживному середовищі не росте. Можливе формування колоній деяких актиноміцетів і грибів, які легко диференціюються від штамів сибірки, а також колоній восковидної бацили. Для диференціації останніх від збудника сибірки в чисту чашку Петрі з фільтрувальним папером наливають 1-2 мл 25% водного розчину аміаку. Чашки відкривають, на декілька секунд вносять в кришку з аміаком, і знову закривають попередньою кришкою. Колонії восковидної бацили активно ферментують лужну фосфотазу і набувають рожевого або червоного кольору, а колонії сибірки залишаються не зафарбованими. З усіх не зафарбованих колоній, як шорстких, сухих, так і гладких слизуватих роблять мазки і фарбують капсульно-соматичною люмінесцентною сироваткою. Для подальшого дослідження відбирають колонії, в мазках з яких виявляються палички із специфічним світінням (з капсулою, або без неї).
Первинна ідентифікація збудника сибірки
З відібраних колоній роблять висіви в пробірки з бульйоном Хотінгера і на чашки з содовим агаром. Останні вміщують в анаеростат, в якому заміщають 50% повітря вуглекислим газом. При відсутності анаеростату можна використовувати ексикатор з притертою кришкою. На дно ексикатора (на кожний літр об'єму) насипають 0,4 г двувуглекислої соди і додають 0.35 мл концентрованої соляної кислоти. Після внесення чашок Петрі з посівами, ексикатор закривають кришкою і злегка нахиляють, для з'єднання соди з кислотою. Облік результатів проводять через 24 години інкубації при температурі 37 град. С. На бульйоні Хотінгера відмічається придонний ріст у вигляді жмутика вати, над ним середовище прозоре (ріст характерний для штамів I та III типу). Штами збудника сибірки II типу викликають дифузне помутніння середовища.
На содовому агарі штами I і II типів ростуть в S-формі. З колоній роблять мазки, фарбують їх одним із методів для виявлення капсули. В мазках виявляють клітини оточені капсулою. Штами III типу ростуть на цьому середовищі в R-формі, капсула в мазках не виявляється .
З культур, що виросли на содовому агарі готують завись мікробів в фізіологічному розчині, якою заражають білих мишей підшкірно по 0,5 мл. Біопробних тварин, що загинули або залишилися живими після строку нагляду, розтинають і роблять мазки-відбитки з внутрішніх органів і місця введення культури. В мазках-відбитках від загиблих мишей, після зараження штамами I-II типу виявляються капсульні клітини збудника сибірки. В мазках від мишей, що були заражені штамами Ш типу мікробні клітини спостерігаються рідко, в основному в місцях введення культури, капсули вони не мають.. На 2-3 добу, в місці введення культур сибірки всіх типів, у заражених тварин розвивається специфічний драглевий геморагічний набряк. Бульйонні культури всіх типів використовують для постановки тестів з сибірковим бактеріофагом і "перлинового намиста". Остаточна ідентифікація і визначення вірулентності виділених штамів проводиться згідно з пунктом 2.8.
Сукупність ознак штамів сибірки, атипових по капсулоутворенню і вірулентності узагальнені в таблиці.
Біологічні властивості атипових штамів збудника сибірки
----------------------------------------------------------------------
| Ознака | Тип | штаму |
|-----------------------------+-----------------+--------------------|
| | II | III |
|-----------------------------+-----------------+--------------------|
|Морфологічна форма | | |
|колоній: | | |
|А) на селективному середовищі| S | R, RO, O |
|або агарі Хотінгера при | | |
|вирощувані в повітряній | | |
|атмосфері | | |
|Б) на 1 % содовому агарі в | S | R |
|атмосфері з 50% СО2 | | |
|-----------------------------+-----------------+--------------------|
|Ріст на бульйоні Хотінгера | Дифузний мутний |Придонний, середови-|
| | |ще над осадом |
| | |прозоре або злегка |
| | |опалесцююче |
|-----------------------------+-----------------+--------------------|
|Капсулоутворення: | | |
|А) на селективному середовищі| + | |
|або агарі Хотінгера при | | |
|вирощуванні в повітряній | | |
|атмосфері | | |
|Б) на 1% содовому агарі в | + | |
|атмосфері з 50% СО2 | | |
|В) в організмі тварини | + | |
|-----------------------------+-----------------+--------------------|
|Вірулентність: | |смерть на 1-5 добу в|
|- для білих мишей |Смерть на 1-5добу|дозах більше 10^5 |
| | |спор |
|- для морських свинок | -""- |можлива смерть |
| | |поодиноких тварин |
| | |від доз більше 10^5 |
| |не викликає |спор |
|- для кролів |смерті |не викликає смерті |
----------------------------------------------------------------------
В розробці інструкції приймали участь:
від Міністерства охорони здоров'я: Л.М.Мухарська, А.Г.Падченко, Е.А.Лауген;
від Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН:
Е.О.Шабловська, Н.М.Кролевецька, В.І.Кікоть;
від Центральної санепідстанції МОЗ України:
Л.С.Некрасова, В.М.Свита, Л.В.Третьякова, І.М.Капітанова, Н.Б.Видайко, І.В.Присяжнюк;
від Кримської республіканської санепідстанції:
Л.М.Альянакі;
від обласних санепідстанцій:
Донецької - Е.В.Смирнова; Львівської - М.С.Нефедова.
Додаток 1
до Інструкції з лабораторної
діагностики сибірки у
людей, в сировині тваринного
походження та об'єктах
довкілля
Порядок інформування про виділення культур збудників сибірки
Інформація про виділення культури від людей та з об'єктів довкілля подається до Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України телефоном , телефоном-факсом або електронною поштою, не пізніше 12 годин після виділення.
Номер штаму _________________________________________________
Вид штаму ___________________________________________________
Дата та місце виділення _____________________________________
Об'єкт дослідження __________________________________________
Прізвище, ім'я, по батькові, вік хворого ____________________
_____________________________________________________________
Дата направлення матеріалу на дослідження ___________________
Діагноз при виділенні культури від людей ____________________
_____________________________________________________________
Основні властивості штаму ___________________________________
_____________________________________________________________
Підпис __________________
Додаток 2
до Інструкції з лабораторної
діагностики сибірки у
людей, в сировині тваринного
походження та об'єктах
довкілля
Метод фіксації мазків в етиловому спирті з додаванням 3%
перекису водню
При даному методі фіксації мазків спорові і вегетативні форми Вас. anthracis знезаражуються через 30 хв., при цьому не порушується морфологія мікроба і специфічність свічення при фарбуванні люмінісцентними сироватками.
Для приготування фіксуючої рідини у флакон наливають 180 мл етилового спирту 96 % і 20 мл З0%-ного пергідролю. Вміст перекису водню в пергідролі, при необхідності, визначають за методикою, викладеною в Державній фармакопеї.
Фіксуючу рідину можна використовувати протягом місяця, флакон закривають притертим корком і зберігають в темному місці.
Мазки готують на чистих знежирених скельцях загальноприйнятим методом, висушують на повітрі і занурюють в посуд з фіксуючою рідиною. Через 30 хв. мазки витягують і висушують на повітрі. Витримувати мазки більш 30 хв. в фіксуючій рідині небажано. Подальші маніпуляції з мазками проводять як із знезараженим матеріалом.
Методи фарбування капсул
Фарбування по Ребігеру. Мазок на протязі 15-20 секунд фарбують формалінізованим генціанвіолетом, фарбу швидко змивають водою, висушують і мікроскопують.
Бактерії сибірки - темно-фіолетові, касули - червоно-фіолетові.
Фарбування по Бурцеву. Мазок на протязі 5 хвилин фарбують фуксином Циля, розведеним 1:1 дистильованою водою, промивають водою, ополіскують 60 % спиртом, підкисленим оцтовою кислотою, промивають водою, висушують. Бактерії - червоні, капсули - рожеві.
Фарбування по Міхіну. Мазок на протязі 3- 5 хвилин фарбують розчином синьки Льофлера, швидко промивають невеликою кількістю води, висушують. Бактерії - темно сині, капсули - рожеві.
Фарбування по Ольту. Мазок на протязі 1-3 хвилин фарбують 2-3% водним розчином сафраніну, виготовленим безпосередньо перед вживанням (сафранін розчиняють в гарячій воді і фільтрують при підігріванні), промивають водою та висушують. Бактерії - коричневі, капсули - блідо жовті. Капсули більш чітко видно при перегляді мазку у краплі води.
Фарбування по Романовському - Гімзі. Мазок на протязі 15-20 хвилин фарбують розчином фарби Романовського-Гімзи (2-3 краплі фарби на 1 мл нейтральної дистильованої води). Препарат вміщують в чашку Петрі мазком вниз і заливають приготовленою фарбою, промивають водою і висушують. Бактерії - темно-сині, капсули - рожеві.
Метод фарбування спор по Пешкову
На фіксований мазок наливають синьку Льофлера, підогрівають до кипіння над полум'ям пальника на протязі 15-20 секунд. Після охолодження мазок промивають водою і дофарбовують 0,5% водним розчином нейтральроту на протязі 30-60 секунд. Промивають водою, висушують і мікроскопують. Спори - синього кольору, молоді спори можуть зафарбовуватись в чорно-синій колір, протоплазма в рожевий.
Диференційно-діагностичне середовище для виділення Вас.
anthracis
Для диференціації колоній збудника сибірки від колоній спороутворюючих сапрофітів використовують тест виявлення лужної фосфатази.
Первинні посіви або пересіви підозрілих культур на диференційно-діагностичному середовищі інкубують в термостаті при (3 +-1) град. С протягом 18-24 годин.
При наявності росту мікроорганізмів в кришку чашки Петрі вносять 1-2 мл 25 %-ного водного розчину аміаку. Чашку (кришкою вниз) витримують при (20 +-2) град. С протягом 1 хв., після чого візуально або під малим збільшенням мікроскопа проводять облік тесту.
Під дією парів аміаку колонії мікроорганізмів, яким властива фосфатазна активність, стають рожевими.
Вас. anthracis фосфатазна активність не властива і його колонії залишаються безбарвними.
Приготування розчинів інгредієнтів.
Поліміксин М сульфат розчиняють у флаконі в стерильній дистильованій воді і послідовними розведеннями стерильним 0,9%-ним розчином натрію хлориду доводять до концентрації 10000 од/мл.
Невіграмон переносять у скляний флакон або пробірку і розчиняють у 25%-ному водяному розчині аміаку при ретельному перемішуванні скляною паличкою. Далі послідовно розводять стерильним 0,9%-ним розчином натрію хлориду до концентрації 100 мкг/мл.
Миючий засіб "Прогрес" або "Лотос" розводять стерильною дистильованою водою до 0,1%-ної концентрації.
Гризеофульвін в таблетках ретельно розтирають у ступці, розчиняють в стерильній дистильованій воді до вмісту 100 мкг препарату в 1 мл.
Фенолфталеїнфосфат натрію (комерційний 10%-ний розчин) для стерилізації прогрівають на водяній бані при 56 град. С 30 хв.
Приготування диференційно-діагностичного середовища.
Поживний агар в колбах по 100 мл розплавляють в киплячій водяній бані і охолоджують до температури 45-50 град. С. В агар додають основні розчини:
поліміксина М сульфату - 0,5 мл
невіграмона - 0,5 мл
грізеофульвіна - 1,0 мл
миючого засобу "Прогрес" або "Лотос" - 1,0 мл
фенолфталеїнфосфату натрію - 0,1 мл
Примітка: гризеофульвін додають у середовище при підозрі на забруднення матеріалу грибами.
Після перемішування середовище розливають у чашки Петрі і підсушують протягом 1,5-2 год. з відкритими кришками. Диференційно-діагностичне середовище після розливу зберігають в холодильнику протягом 1-2 доби.
Система для постановки реакції диск-преципітації
Для постановки реакції диск-преципітації необхідно мати:
- преципітуючу сибіркову сироватку;
- очищений 1%-ний агаровий гель або 1%-ний агар Дифко;
- рідке поживне середовище, придатне для культивування збудника сибірки.
Приготування системи для постановки реакції диск-преципітації.
Преципітуючу сибіркову сироватку розливають по 0,5-1 мл у стерильні бактеріологічні пробірки. На поверхню сироватки, по стінці пробірки, нашаровують пастерівською піпеткою розплавлений і охолоджений до 45-50 град. С 1%-ний агаровий гель стовпчиком висотою 5-7 мл. Пробірки тримати у вертикальному положенні до охолодження агару.
На поверхню охолодженого агару наносять 1-1,5 мл рідкого поживного середовища. При ідентифікації культур, виділених з об'єктів довкілля і сировини тваринного походження, як рідке поживне середовище, можна використовувати середовище ГКІ або бульйон Хотінгера з 40% інактивованої сироватки крові (крім м'ясо-пептонного бульйону), у цьому випадку одночасно можна провести дослідження і на капсулоутворення.
Систему готують і використовують у день постановки реакції.
Виготовлення очищеного 1%-ного агарового гелю.
Готують нейтральну дистильовану воду рН-7,0. Для цього визначають рН дистильованої води і, в залежності від отриманих результатів, її нейтралізують 1%-ним розчином двовуглекислої соди (при кислій реакції) або 0,1%-ним розчином соляної кислоти (при лужній реакції).
Необхідну для нейтралізації кількість розчину визначають так: до 100 мл води невеличкими порціями (мілілітрами або краплями) додають один із зазначених розчинів, постійно визначаючи рН; при досягненні нейтральної реакції (рН-7.0) точно розраховують кількість розчину, необхідного для нейтралізації всього обсягу дистильованої води.
5 г агар-агару заливають 300 мл нейтральної дистильованої води і нагрівають у киплячій водяній бані до повного розплавлення агар-агару.
Одночасно готують водяний розчин білку курячого яйця. Беруть охолоджене яйце масою не менше 56 г і відокремлюють білок, який старанно збивають до утворення пінистої маси і розчиняють у 200 мл нейтральної дистильованої води. Приготовлений розчин білка ділять на дві частини по 100 мл.
У розплавлений агар добавляють 0,5 г хлористого кальцію (CaCl2 x 6Н2О), перемішують і охолоджують до 45-50 град. С. До суміші додають 100 мл водного розчину білка курячого яйця, ставлять у киплячу водяну баню і нагрівають до появи пластівців коагуляції (приблизно 15-20 хв.).
Якщо білок не згортається або коагуляція проходить погано, вносять ще 0,25-0,5 г хлористого кальцію і продовжують нагрівати до появи пластівців коагуляції.
Гарячий агар фільтрують через попередньо змочений у гарячій дистильованій воді і віджатий ватний фільтр.
До профільтрованого агару додають другу частину (100 мл) водного розчину яєчного білка, перемішують і знову нагрівають у киплячій водяній бані до появи пластівців коагуляції. У випадку поганого згортання білка, роблять так, як і при внесенні першої порції (див. вище).
Після згортання білка агар знову фільтрують у гарячому виді. Очищений 1%-ний агаровий гель повинен бути прозорим. Відфільтрований агаровий гель розливають в пробірки або колби і стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 20 хв. Якщо після автоклавування випадає осад, агаровий гель фільтрують і стерилізують повторно.
Готове середовище зберігають в холодильнику (2-4 град. С) і використовують протягом 6 місяців. Для запобігання висихання пробірки з агаровим гелем загортають у поліетиленовий пакет.
Середовище ГКІ
Для приготування середовища до розчину Хенкса з бікарбонатом натрію або бульйону Хотінгера додають 40% стерильної бичачої сироватки крові, інактивованої при 56 град. С протягом 70 хв.
Після змішування компонентів рН середовища 5%-ним розчином бікарбонату натрію доводять до 7,2-7,4
Постановка тесту "перлинового намиста"
Перед постановкою тесту готують стерильний МПА і розливають у три пробірки по 10 мл (або 3 колби по 100 мл).
У 2 пробірки (колби) із розплавленим і охолодженим до 45-50 град. С агаром стерильно вносять пеніцилін із розрахунку 0,5 і 0,05 ОД на 1 мл середовища, третя - контрольна.
Одержання необхідної концентрації пеніциліну:
-------------------------------------------------------------------
|NN |Кількість |Кількі-|Отримана| Кількість середовища |
|пп |розчиненого |сть |концент-|-----------------------------|
| |пеніциліну |МПА, |рація | 100 мл | 10 мл |
| | |що | |--------------+--------------|
| | |додає- | |Внося-|Концен-|Внося-|Концен-|
| | |ться | |ть |трація |ть |трація |
| | |(мл) | |розчи-|пеніци-|розчи-|пеніци-|
| | | | |ну |ліну |ну |ліну |
| | | | |пеніци|(од/мл)|пеніци|(од/мл)|
| | | | |-ліну | |-ліну | |
| | | | |(мл) | |(мл) | |
|---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 1 | 100000 од | 10 | 10000 | | | | |
|---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 2 |1 мл розв. № 1| 9 | 1000 | | | | |
|---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 3 |1 мл розв. № 2| 9 | 100 | 0,5 | 0,5 | | |
|---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 4 |1 мл розв. № 3| 9 | 10 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
|---+--------------+-------+--------+------+-------+------+-------|
| 5 |1 мл розв. № 4| 9 | 1 | | | 0,5 | 0,5 |
-------------------------------------------------------------------
Додаток 3
до Інструкції з лабораторної
діагностики сибірки у
людей, в сировині тваринного
походження та об'єктах
довкілля
ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ B.ANTHRACIS ТА СПОРІДНЕНИХ СПОРОУТВОРЮЮЧИХ АЕРОБІВ
------------------------------------------------------------------
| Ознака |B.anth-|B. | B. |B.sub- |B.subti- |B.megate-|
| |racis |cereus | cereus |tilis |lis var. | rium |
| | | | var. | |mesente- | |
| | | |mycoides| | ricus | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Капсулоут- | + | - | - | - | - | - |
|ворення в | | | | | | |
|атмостфері | | | | | | |
| з | | | | | | |
|підвищенним| | | | | | |
|вмістом СО2| | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| Рухомість | - | + | + | + | + | + |
| (висяча | | | | | | |
| крапля) | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Гемоліз ЕБ | - | + | + | +- | +- | - |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| Ріст на |Середо-|Середо-|Середо- |Бульйон|Бульйон |Помутнін-|
| рідких |вище |вище |вище |мутний,|залишає- |ня |
|середовищах|прозоре|мутне, |прозоре,|при |ться |середови-|
|на бульйоні|з |осад |на дні |утворе-|прозорим,|ща, без |
| |осадом |крихопо|осад у |нні |на |плівки, |
| |(у |дібний,|вигляді |плівки |поверхні |осад |
| |вигляді|не |"жмутка |просві-|зморщена |незначний|
| |"жмутка|розбива|вати", |тлюєть-|плівка | |
| |вати"),|-ється,|не |ся | | |
| |без |міцна |розбива-| | | |
| |плівки,|плівка |ється, | | | |
| |кільце |(може |без | | | |
| |навколо|тільки |плівки | | | |
| |стінок |навколо| | | | |
| |легко |стінок)| | | | |
| |змиває-| | | | | |
| |ться | | | | | |
| | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| На молоці |Підкис-|Пепто- |Пептоні-|Підлу- |Пептоні- |Пептоні- |
| |лення, |нізація|зація; |ження, |зація |зація |
| |згорта-|швидка,|згортан-|повіль-|повільна,|відсутня,|
| |ння і |із |ня |на |іноді |згортання|
| |пепто- |згортан|відсутнє|пептоні|згортання|відсутнє |
| |нізація|ням або| |-зація,| | |
| |(пові- |без | |згорта-| | |
| |льна) |нього | |ння | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| Ріст на |Сіро- |Колонії|Колонії |Колонії|Товстий |Колонії |
| твердих |білі, |білі |у |білі |матово- |слизуваті|
|середовищах|як |тверді,|вигляді |або |білуватий|жовто- |
| На агарі |пушинки|круглі,|повсті, |сірува-|зморшений|ділі, |
| |колонії|іноді |повзучі |ті, |наліт, |темніють |
| |при |жовту- |по |повзучі|утворює |при |
| |збіль- |ваті, |поверхні|на |плівку в |наявності|
| |шенні у|по |середо- |стінки |конденса-|тирозину |
| |вигляді|краях |вища |пробір-|ті | |
| |"гриви |хвиляс-| |ки, у | | |
| |лева" |ті | |конден-| | |
| | |нитки | |саті | | |
| | | | |плівка | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Лакмусова |Черво- | Синіє | Синіє | Синіє | Синіє | - |
|сироватка | ніє | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Ферментація| +- | + | + | - | +- | - |
|згорнутого |(пові- | | | | | |
|яєчного |льно) | | | | | |
|середовища | | | | | | |
| | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Арабінози | - | - | - | + К | + К | +- К |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Ксилози | - | - | - | + К | + К | +- К |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Крохмалю | + | + | + | + | - | + |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Саліцину | +- | + | Даних | Даних | + | Даних |
| |(пові- | | немає | немає | | немає |
| |льно) | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Відновлюва-| - | + | - | +- | - | Даних |
|ння | | | | | | немає |
|метиленово-| | | | | | |
|го синього | | | | | | |
|в | | | | | | |
|середовищі | | | | | | |
|(через 48 | | | | | | |
|год.) | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Утворення | - | +- | +- | - | - | +- |
|уреази | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Редукція | +- | +- | +- | + | - | +- |
|нітратів | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Реакція | + | - | +- | + | + | - |
|Фогес- | | | | | | |
|Проскауера | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Чутливість | + | - | - | - | - | - |
|до | | | | | | |
|пеніциліну | | | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
|Патоген | + |Патоген| - | - | - | - |
|ність: | |ний при| | | | |
|Для мишей | |в/черев| | | | |
| | |-ному | | | | |
| | |введен-| | | | |
| | |ні | | | | |
| | |великих| | | | |
| | |доз | | | | |
|-----------+-------+-------+--------+-------+---------+---------|
| Для | + | - | - | - | - | - |
| морських | | | | | | |
| свинок і | | | | | | |
| кролів | | | | | | |
------------------------------------------------------------------