І Н С Т Р У К Ц І Я
для медичного застосування
АЛКОТЕСТ
набІРРЕАКТИВІВ
ПРИЗНАЧЕННЯ
Набір використовується для кількісного аналізу етанолу в біологічних рідинах (цільній крові, плазмі, сироватці, слині та сечі) і призначений для використання вклініко-діагностичній та науково-дослідній практиці, а також судмедекспертизі вякості засобу первинного скринінгу проб.
Набір придатний для визначення етанолу в лікарських препаратах, харчових продуктах та бродильних середовищах.
Набір розраховано на 100аналізів (при об'ємі проб 4 мл).
Набір зберігати при температурі від 00С до +80С.
ПРИНЦИП МЕТОДУ
Етанол при дії алкоголь оксидазиокислюється киснем повітря до ацетальдегіду та перекису водню. Останній ус упряженій пер оксидазній реакції окислює хромоген до кольорового продукту, який визначається фотометрично:
алкоголь-
СН3СН2ОН + О2 оксидаза СН3СНО+ Н2О2
SН2+Н2О2 пер оксидаза S + 2Н2О
барвник
РЕАКТИВИ
1. " Хромоген". Суха суміш хромогену із складниками фосфатного буферу (2,45 г).
2. " Ферменти". Стабілізована суспензія алкоголь оксидази і пер оксидази в сульфаті амонію.
3." Стандарт". Калібру вальний розчин етанолу,10 г/л (стабілізований).
4. " Осаджувач".40%-ийрозчин три хлороцтової кислоти (10 мл).
Додатковий реактив: 0,8 М НСІ (концентровану соляну кислоту розводять в 15 разів водою: 10 мл кислоти + 140 мл води).
ДОПУСТИМІ ВЕЛИЧИНИ ВМІСТУАЛКОГОЛЮ В БІОЛОГІЧНИХ РІДИНАХ ЛЮДИНИ
Сироватка, плазма та цільна кров -до 0,25 г/л (порогова норма).
Перевищення величини 1 г/л приймається як юридичний доказ алкогольного сп'яніння.
Відтворювальність (коефіцієнт варіації) – (5-7)% (залежно від діапазону концентрацій).
Лінійність калібрувальної кривої -до концентрації алкоголю 4,5 г/л у вихідній пробі (до 45 мкг спирту вфотометрованому розчині), що відповідає оптичній густині до 1,0 - 1,3.
ПРИГОТУВАННЯ РОБОЧОГОРЕАГЕНТУ
1." Хромоген". Вміст флакону 1 помістити в термостійкий стакан або колбуна 0,5 л, додати 350 мл дистильованої води і нагріти суміш до повного розчинення. Перед використанням розчин охолодити до кімнатної температури.
Зберігати розчин у герметично закритій посудині при температурі від +80С до +200С у затемненому місці до 2-х тижнів.
2. " Реагент". У день аналізу помістити збовтану суспензію ферментів із флакону 2 у приведений докімнатної температури розчин хромогену і суміш добре розмішати.
Реагент використовують у день приготування.
П р и м і т к а: При проведенні меншого числа аналізів готують відповідну кількість реагенту, змішуючи розчин хромогену та збовтану суспензію ферментів у співвідношенні 700:1, а саме:
Vxp = 3,5·N(мл); Vе = 0,5N/100 (мл);
де Vxp - об'єм розчину хромогену, мл;
Vе - об'ємсуспензії ферментів, мл;
0,5 - паспортний об'ємсуспензії ферментів, мл;
N - число аналізів (включаючи сліпу та калібрувальну проби).
3. " Стандарт". Розвести стандартний розчин етанолу в 10 разів водою (0,1 мл + 0,9 мл Н2О).
Розчин використовують у день приготування як калібрант з концентрацією 1 г/л.
П р и м і т к а: Усі операції зі спиртом слід проводити дуже ретельно, запобігаючи випадковому попаданню його в реагенти.
4. " Осаджувач". Вміст флакону 4 (10 мл 40% ТХО) розвести в 10 разів водою (додати 90 мл Н2О).
П р и м і т к а: " Осаджувач" є концентрованим розчином сильної кислоти, тому при роботі з ним необхідно дотримуватисьвідповідних правил техніки безпеки.
ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ
Довжина хвилі - 450 нм (спекрофотометр або фотоколориметр).
Кювети 1 см.
Температура інкубації - кімнатна (близько 200С).
Підготовка проб крові (сироватки чи плазми).
У невеликі скляні пробірки вносять по 0,1 мл проб щойно взятої крові (для дезинфекції використовують водний розчинріванолу), додають до них по 0,9 мл розведеного (4%) розчину" осаджувача" і струшують. Проби витримують при кімнатній температурі 5 хв і центрифугують для осадження білків при 3000 об/хв протягом 10 хв. Для аналізу використовують над осадову рідину.
Аналогічно обробляють сліпу такалібрувальу проби.
| Розчин
| Дослідна проба
| Калібрувальна проба
| Сліпа проба
|
| 4%-ний осаджувач, мл
| 0,9
| 0,9
| 0,9
|
| Кров (сироватка або плазма), мл
| 0,1
| -
| -
|
| Калібру вальний розчин етанолу (1 г/л), мл
| -
| 0,1
| -
|
| Вода, мл
| -
| -
| 0,1
|
Аналіз проводять серійно по 20-30 дослідних проб із постановкою в кожній серії калібрувальної та сліпої проб за такою схемою:
| Розчин
| Дослідна проба
| Калібрувальна проба
| Сліпа проба
|
| Над осадова рідина (відповідна для кожної проби), мл
| 0,1
| 0,1
| 0,1
|
| Робочий реагент, мл
| 3,5
| 3,5
| 3,5
|
Реакцію запускають додаванням робочого реагенту в точно фіксований час із інтервалом, наприклад, в 30 с між пробами.
Зупиняють реакцію через 20 хв додаванням до всіх проб по 0,5 мл 0,8 М НСІ у тій жечасовій послідовності, яка витримувалась при внесенні робочого реагенту.
Проби фотометрують при 450 нм проти сліпої. Реакційна суміш перед додаванням кислоти має блакитне забарвлення, якев кислому середовищі переходить у жовте.
Розрахунок концентрації алкоголю (вг/л або проміле 0/00) у кожній серії проводять за своєю калібрувальною пробою згідно з формулою:
С = Ед/Екл
де Ед і Екл -оптичні густини дослідної та калібрувальної проб відповідно, виміряні проти сліпої проби.
ПРИМІТКИ. 1. Час інкубації можна змінювати (10-25 хв) але дотримання однакового часу для всіх проб єобов'язковим.
2. При визначенні алкоголю в сечі операцію осадження білків опускають і при аналізі використовують 0,02 мл сечі, а в калібрувальній пробі – 0,02 мл розчину етанолу з концентрацією 1 г/л.
Час інкубації - 10 хв. Формула розрахунку така ж, як приведена вище.
3. Для сироватки крові (але нецільної крові) допустимо проводити експрес-аналіз і без осадження білків. Дляцього використовують 0,02 мл сироватки, а в калібрувальній пробі – 0,02 млрозчину етанолу з концентрацією 1 г/л. Час інкубації - 10 хв. Формула розрахунку не змінюється. Похибка при аналізі алкоголю дещо зростає, проте для експресного виявлення алкогольного сп'яніння (С>1 г/л) такий варіант допустимий.
4. При проведенні аналізу недопустима наявність в лабораторії парів метанолу, етанолу, інших спиртів ілетких окислюючих та відновлюючих агентів.
5. При наявності в лабораторіїфотоелектроколориметра із зменшеним об'ємом фотометрованих проб (0,5 – 1,0 мл), наприклад, " Мефан-8001", можна пропорційно зменшити дозу реагентів навсіх етапах визначення.
6. Алкогольоксидаза специфічна якдо етанолу, так і метанолу (причому останній окислюється в 10 разів ефективніше), тому в особливих випадках для виявлення метилового спирту слід провести газо-рідинну хроматографію. Источник
Термін зберігання. 6 місяців.