ІНСТРУКЦІЯ
для медичного застосування ДІАГНОСТИЧНОГО НАБОРУ РАДІОІМУННОГОАНАЛІЗУ СТАТЕВИХ ГОРМОНІВ
(СТЕРОН-Е 3-125І; РІА-ТЕСТОСТЕРОН-СТ; РІА-ТЕСТОСТЕРОН-ПР;
РІА-ПРОГЕСТЕРОН-СТ; РІА-ПРОГЕСТЕРОН-ПР; РІА-ЕСТРАДЮЛ-СТ;
РІА-ЕСТРАДЮЛ-ПР; РІА-ПРОЛАКТИН-ПР; РЮ-ПЛ-125І;
РІА-КОРТИЗОЛ-СТ)
ЗАГАЛЬНАХАРАКТЕРИСТИКА:
набір реактивів для кількісного визначення статевих гормонів :
(СТЕРОН-Е3-125І; РІО-ПЛ-125І; РІА-ТЕСТОСТЕРОН-СТ; РІА-ТЕСТОСТЕРОН-ПР; РІА-ПРОГЕСТЕРОН-СТ; РІА-ПРОГЕСТЕРОН-ПР; РІА-ЕСТРАДЮЛ-СТ; РІА-ЕСТРАДЮЛ-ПР; РІА-ПРОЛАКТИН-ПР; РІА-КОРТИЗОЛ-СТ) методом радіо імунологічного аналізу в сироватці крові людини.
ОСНОВНІФІЗИКО-ХІМГЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
СКЛАД: наведений у табл.1
Таблиця 1
| Склад наборів
| Найменування наборів
| | | | | | | | | |
| | Стерон
E3 - 125І
| РІО-ПЛ-
125І
| РІО-
тесто-сте-рон-
СТ
| РІО-
тесто-сте-рон-
ПР
| РІО-
про-гес-те-рон-СТ
| РІО-
про-гес-те-рон-ПР
| РІО-
естра-
діол-СТ
| РІО-
естра-
діол-ПР
| РІО-
про-лак-тин-СТ
| РІО-
про-лак-тин-ПР
|
| АКТИВНІСТЬ[125І]-МІТКИ ,
ліофілізованого або рідкого препарату, 1 флакон
| 60-150 кБк
| 30-60 кБк
| 70-150 кБк
| 60-150 кБк
| 70-150 кБк
| 60-150 кБк
| 70-150 кБк
| 60-150 кБк
| 60-120 кБк
| 70-150 кБк
|
| Калібровані проби (Со-С6) у діапазоні концентрацій нмоль / л або нг/мл
| 0 2 5 15 50 200 нмоль /л
| 0 5 10 20 50 100 нмоль /л
| 0-100 6 фл. нмоль
/л
| 0 1
3 10
зо
100 нмоль
/л
| 0-100 6 фл. нмоль
/л
| 0 1 3 10 ЗО 100 нмоль /л
| 0-10 6 фл. нмоль
/л
| 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10,0 нмоль /л
| 0-208 6 фл. нг/мл
| 0-2000 нмоль л
|
| Анти сироватка, ліофілізований препарат
| 1 фл.
| 1 фл.
| | 1 фл
| | 1 фл
| | 1 фл
| Іфл
| |
| Буферний розчин
| | 1 фл.
| | | | | | | | |
| Система розділення (імуносорбент), суспензія
| | 1 фл.
| | | | | | | | |
| Преципітуючий реагент
| 1 фл.
| | | 1 фл.
| | 1 фл.
| | 1 фл.
| 1 фл.
| |
| Контрольна сироватка, ліофілізований препарат
| 1 фл.
| 1 фл.
| 1 фл.
| Іфл.
| 1 фл.
| 1 фл.
| 1 фл.
| 1 фл.
| 1 фл.
| 1 фл.
|
| Пробірки з [мобілізованими моноклональними антитілами, шт.
| | | 100
| | 100
| | 100
| | | 100
|
ФОРМА ВИПУСКУ
Набір реактивів мічених 125І.
ПРИЗНАЧЕННЯНАБОРУ
Набір призначений для кількісного визначення статевих гормонів у сироватці крові людини методомрадіо імунологічного аналізу " ін вітро".
ХАРАКТЕРИСТИКАНАБОРУ
Набір розрахований на проведення аналізу в дублікатах 42 невідомих проб, 6 каліброваних проб і 1контрольної сироватки, а також 1 проби загальної активності [125І]-мітки гормону (усього 100 визначень).
ЗАПОБІЖНІ ЗАХОДИПРИ РОБОТІ З НАБОРОМ
Усі компоненти набору, за винятком [125І]-мітки гормону, є нетоксичними.
[125І]-мітка гормонує джерелом м'якого гамма-випромінення.
Період піврозпаду ізотопу [125I]-60,04доби.
При роботі з набором слід додержуватися правил роботи з радіо активними речовинами (РР) по групі В (Норми радіаційної безпеки НРБУ-97 та Основні санітарні правила протирадіаційного захисту (ОСПУ) роботи з радіо активними речовинами й іншими джерелами іонізуючих випромінювань).
Увага!
Хімічний посуд і устаткування, що використовуються при роботі з РР, повинні бути відповідним чином маркіровані і зберігатись окремо.
Забороняється при роботі зРР тримати на робочому місці стороннє устаткування й особисті речі.
Категорично забороняється прийом їжі, використання косметичних засобів і паління в помешканнях, призначених для роботи з PP.
У сироватці крові, використаної як компонент набору, не виявлено вірусів ВІЛ і гепатиту В. Проте компоненти набору слід розглядати як потенційне джерело вірусної інфекціїі-використовувати при роботі з набором одноразові гумові або пластикові рукавички.
УМОВИ ЗБЕРІГАННЯІ ЗАСТОСУВАННЯ НАБОРУ
Набір гормонів статевої групи повинний зберігатися при температурі 2-8 °С протягом усього терміну придатності набору. Компоненти набору, підготовлені до роботи, можуть зберігатися при температурі 2-8 °С протягом 3 діб. При розчиненні ліофілізованих компонентів набору необхідно стежити, щоб на пробках не залишилося сухої речовини. Визначальні зразки сироватки крові слід перевіряти на залишковурадіо активність, якщо особі, яка обстежується, до відбору крові вводилирадіо активні препарати. Не слід використовувати для аналізу гемолізовані, каламутні сироватки, а також сироватки з підвищеним утриманням ліпідів. Длявідбору і додавання компонентів рекомендується використовувати напівавтоматичні піпетки, атестовані на точність за значенням середньої дози.
Для одержання надійних результатів необхідно суворе дотримання інструкції для застосування набору і кваліфіковане проведення аналізу.
УСТАТКУВАННЯ ІМАТЕРІАЛИ, ЩО НЕОБХІДНІ ДЛЯ
ПРОВЕДЕННЯАНАЛІЗУ
Напівавтоматичні піпетки зі змінними наконечниками, що дозволяють відбирати обсяги рідин 0,05; 0,1; 0,5;1,0; 10,0 мл; скляні або пластикові (прозорі) пробірки для проведення аналізу місткістю 3-5 мл;
штатив для пробірок; вихровий змішувач типу ВП;
центрифуга з горизонтальним ротором, що розвиває прискорення 1500-2000 g, значення визначається за формулою:
g= 1,118 * 10-5 *(об/хв)2 * R,
де: R - радіус ротора центрифуги в см;
пристрій для струшування пробірок;
водоструминний насос;
гамма-лічильник, що дозволяє вимірювати активність ізотопу [125І];
дистильована вода.
ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ:
а) визначення естріолу (набірСТЕРОН-Ез-125І)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакон із препаратом [125І]-Ездолити 11 мл дистильованої води і лишити на 10 хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакона обережно перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакон із препаратоманти сироватки долити 11 мл дистильованої води і лишити на 10 хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакона перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакони, що містять калібровані проби і контрольну сироватку, долити по 0,5 мл дистильованої води і лишити на 30 хвилин, до повного розчинення таблеток. Перемішати, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах): Т - для визначення загальної активності [125І]-Ез у пробірці;
Вн - для визначення неспецифічного зв'язування;
Во - В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для визначення концентрації естріолу в контрольній сироватці;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл розчину і внести у відповідні аналітичні пробірки: В, Вн - 0 нмоль/л; В1 - 2 нмоль/л; В2- 5 нмоль/л; Вз - 15 нмоль/л; В4 - 50 нмоль/л; В5- 200 нмоль/л. У пробірки Вкс внести по 0,05 мл контрольної сироватки. У пробірки Вх внести по 0,05 мл аналізованої сироватки крові пацієнтів.
У пробірки Вн внестипо 0,1 мл дистильованої води і по 0,9 мл розчину преципітуючого реагенту.
У всі пробірки долити по 0,1 млрозчину [125І]-Ез.
Вміст флакона з анти сироваткоюперенести у флакон із преципітуючим реагентом, старанно перемішати до утворення гомогенної суспензії.
У всі пробірки, крім Т і Вн, внести по 1,0 мл суміші преципітуючого реагенту з анти сироваткою. Вміст пробірок старанно перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки протягом 2 годин при кімнатній температурі (18-25 °С). Усі пробірки, крім Т, центрифугувати при кімнатній температурі (18-25 °С) у центрифузі з горизонтальним ротором, при прискоренні 1500-2000 g, протягом 20 хвилин.
Акуратно видалити над осадовурідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку кожної пробірки протягом однієї хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середні арифметичні значення швидкостей рахунку- [12зІ]-Ез для кожної пари пробірок. З отриманих значень швидкостей рахунку відняти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [12:>І]-Ез у пробірках Вн(неспецифічно пов'язаний [125І]-Ез). Не віднімати середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-Ез у пробірках Вн із середнього арифметичного значення швидкості рахунку[125І]-Ез у пробірках Т.
Розрахувати відношення (Во-Вн)/Т, у відсотках, де: Во - середня швидкість рахунку в пробірках, щомістять пробу 0 нмоль/л;
Вн - середня швидкість рахунку неспецифічно пов'язаного [125І]-Ез у пробірках Вн;
Т - загальна активність [125І]-Ез, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробах Т.
Значення (Во-Вн) ЛГповинно бути не менше 30%.
Розрахувати розмір (В-Вн)/(Во-Вн), у відсотках, для кожної каліброваної, контрольної і невідомої проби, де В -середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольні або невідомі зразки.
Побудувати для каліброваних проб графік залежності (В-Вн)/(Во-Вн) у відсотках, від концентрації естріолу в пробах (нмоль/л) у координатах"logit-log".
За каліброваним графіком визначити вміст естріолу в досліджуваних зразках сироватки крові.
Для переведення молярної концентрації в об'ємно-масову слід користуватися співвідношенням:
мкг естріолу/л = нмоль/л х 0,288;
б) визначення плацентарноголактогену (РІО-ПЛ-125І)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
Для аналізу може бути використана як сироватка, так і плазма крові людини.
Сироватку (плазму) крові людини необхідно зберігати при температурі 2-8 °С, якщо аналіз буде виконуватися протягом 24 годин після взяття крові. Для більш тривалого збереження сироватку розливають на аліквоти і зберігають при мінус 20 °С.
Зразки, в яких кількість ПЛперевищує 100 нмоль/л, перед аналізом розбавляють буферним розчином або аналіз здійснюють із меншими обсягами сироватки - 0,010; 0,025; 0,050 мл. В останньому варіанті обсяг інкубаційної суміші доводять до 0,400 мл за допомогою додавання буферного розчину.
Не допускається:
застосування для аналізу сироватки після двократного і більш розморожування;
визначення ПЛ у гемолізованійсироватці крові.
У флакон із препаратом [125І]-ПЛвнести 11 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин до повного розчинення таблетки. Перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакон із препаратоманти сироватки внести 11 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин доповного розчинення таблетки. Перемішати, уникаючи утворення піни.
У кожній флакон, що містить калібровану пробу і контрольну сироватку, внести по 0,5 мл дистильованої води ізалишити на 30 хвилин, до повного розчинення таблеток. Акуратно перемішати, уникаючи утворення піни.
Буферний розчин перелити всклянку на 200 мл, додати 140 мл дистильованої води, акуратно перемішати.
Імуносорбент перед використанням старанно перемішати на магнітній мішалці до одержання однорідної суспензії і продовжувати перемішувати при додаванні в аналітичні пробірки.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах):
Т -для визначення загальної активності [125І]-ПЛ у пробірці;
Вн- для визначення неспецифічного зв'язування;
Во- В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для пробірок із контрольною сироваткою;
Вх - для досліджуваних зразків.
У всі пробірки, крім Т, внестипо 0.1 мл буферного розчину. У пробірки Вн - по 0,2 мл.
У всі пробірки внести по ОД млрозчину [125І]-ПЛ.
З кожного флакона з каліброваними пробами відібрати по ОД мл розчину і внести у відповідні аналітичні пробірки: Во, Вн - 0 нмоль/л; В1 -5 нмоль/л; В2 - 10 нмоль/л; Вз - 20 нмоль/л; В4- 50 нмоль/л; В4 - 100 нмоль/л. У пробірки Вкс - по ОД мл контрольної сироватки. У пробірки Вх - по ОД мл досліджуваних проб.
У всі пробірки, крім Т і Вн, внести по ОД мл розчину анти сироватки.
Вміст кожної пробірки старанно перемішати на вихровому змішувачі і залишити на одну годину при кімнатній температурі (18-25 °С).
У всі пробірки, крім Т, внестипо 0,1 мл імуносорбенту, що протягом усього часу додавання в проби перемішувати на магнітній мішалці.
Усі пробірки інкубують при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 1,5 години, при постійному струшуванні на приладі для струшування пробірок із частотою вібрації,. . що запобігає утворенню осаду в пробірках (шейкері).
Усі пробірки, крім Т, одночасно центрифугувати при 1500-2000 g протягом 20 хвилин при кімнатній температурі (18-25°С).
З усіх пробірок, крім Т, видалити над осадову рідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
У кожну пробірку, крім Т, додати по 1 мл буферного розчину, пробірки струснути 5 хвилин на приладі для струшування пробірок.
Усі пробірки, крім Т, одночасно центрифугувати при 1500-2000 g протягом 20 хвилин при кімнатній температурі (18-25°С).
З усіх пробірок, крім Т, видалити над осадову рідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку [125І] у кожній пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середні арифметичні значення швидкостей рахунку [ 125І] для кожної пари пробірок. З отриманих значень швидкостей рахунку відняти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-ПЛ у пробірках Вн (неспецифическипов'язаний [125І]-ПЛ). Не віднімати середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-ПЛ у пробірках Вн із середнього арифметичного значення швидкості рахунку [125І]-ПЛ у пробірках Т.
Розрахувати відношення (Во-Вн) ЛГ, у відсотках, де:
Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять пробу 0 нмоль/л;
Вн - середня швидкість рахунку в пробірках Вн;
Т - загальна активність [125І]-ПЛ, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробах Т.
Значення (Во-Вн)/Тповинно бути не менше 40%.
Розрахувати рівень (В-Вн)/(Во-Вн), у відсотках, для кожної каліброваної, контрольної і невідомої проб, де В -середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані проби, контрольну сироватку, невідомі зразки.
Побудувати графік залежностіВ/Во, у відсотках, від концентрації ПЛ у каліброваних пробах (нмоль/л) у координатах "logit- log".
За каліброваним графіком визначити рівень ПЛ у контрольній сироватці й у досліджуваних зразках сироватки крові.
Для переведення молярної концентрації ПЛ у масово-об'ємну слід користуватися співвідношенням:
нмоль/л х 0,022 = мкг/мл (мг/л);
в) визначення тестостерону (РІА-ТЕСТОСТЕРОН-СТ)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілизовані) і контрольну сироватку, внести по 0,5 мл дистильованої води. Перемішати до повного розчинення препаратів, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Аналітичні пробірки помістити вштатив і кожну пару пробірок маркірувати позначенням того розміру, для виміру якої вони призначені:
Т - для визначення загальної активності [125І]-тестостерону в пробірці;
Во - В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - Для пробірок із контрольною сироваткою;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл сироватки і внести в пробірки Во -В5. З флакона з контрольною сироваткою відібрати по 0,05 мл упробірки Вкс. У пробірки Вх внести по 0,05 мл аналізованої сироватки крові пацієнтів.
У всі пробірки внести по 0,5 млрозчину [125І]-тестостерону. Вміст пробірок перемішати" на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки при температурі 20-25 °С протягом 3 годин, при постійному струшуванні (не менше 300струшувань на хвилину).
З усіх пробірок, крім Т, цілком видалити вміст за допомогою водоструминного насоса.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку [125I]-тестостерону в кожній пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-тестостерону для кожної пари пробірок.
Розрахувати співвідношення Во/Т, у відсотках, де Т - загальна активність [125І]-тестостерону, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т; Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровану пробу Co. Значення Во/Т повинно бути не менше 30%.
Розрахувати співвідношення В/Во, у відсотках, для кожної пари пробірок каліброваних, контрольної і невідомих проб, де В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольну і невідомі проби.
У напівлогарифмичнихкоординатах (вісь абсцис - логарифмічна, вісь ординат-лінійна) або координатах"logit-log" побудувати графік залежності В/Во, у відсотках (вісь ординат), від концентрації тестостерону (вісь абсцис) у каліброваних пробах.
Для невідомих і контрольної проб сироватки крові на підставі: відповідних значень В/Во, У відсотках, за каліброваним графіком визначити вміст тестостерону.
Для переведення молярної концентрації тестостерону в масово-об'ємну слід користуватися співвідношенням:
мкг/л (нг/мл) = нмоль/л х 0,288;
г) визначення тестостерону (РІА-ТЕСТОСТЕРОН-ПР)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакон із препаратом [125І]-тестостерону (якщо препарат ліофілізований) долити 11 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакона обережно перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакон із анти сироваткою до тестостерону (якщо препарат ліофілізований) долити 10 мл дистильованої води ізалишити на 10 хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакону перемішати, уникаючи утворення піни.
Вміст флакона з анти сироваткоюдо тестостерону перенести у флакон із преципітуючим реагентом, старанно перемішати до утворення гомогенної суспензії.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, долити по 0,5 мл дистильованої води і залишити на 30 хвилин, до повного розчинення таблеток. Перемішати, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах):
Т - для визначення загальної активності [125І]-тестостерону, у пробірці;
В - В5 - для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для визначення концентрації тестостерону в контрольній сироватці;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл розчину і внести у відповідні аналітичні пробірки: В - 3; В1 - С1; В2 - С2, Вз -Сз; В4 -С4,В5 - С5.
У пробірки Вкс внести по 0,05мл контрольної сироватки.
У пробірки Вх внести по 0,05 мланалізованої сироватки крові пацієнтів.
Примітка. При визначенні тестостерону у пацієнтів ізявно високим рівнем гормону (більше 100 нмоль/л) зразки аналізованої сироватки необхідно попередньо розвести' сироваткою крові з низьким вмістом тестостерону, наприклад нормальною сироваткою крові жінок, у 10 разів. Рекомендується попередньо виміряти концентрацію тестостерону в сироватці, що використовується для розведення.
Рівень тестостерону в сироватці-розріджувачі менше 2 нмоль/л можна зневажити.
У всі пробірки долити по 0,1 млрозчину [125І]-тестостерону.
У всі пробірки, крім Т, внестипо 1,0 мл суміші преципітуючого реагенту з анти сироваткою до тестостерону.
Зміст пробірок старанно перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубують усі пробірки протягом 2 годин, при кімнатній температурі (18-25 °С).
Усі пробірки, крім Т, центрифугувати при кімнатній температурі (18-25°С), у центрифузі з горизонтальним ротором при прискоренні 1500-2000 g, протягом 20 хвилин.
Акуратно видалити над осадовурідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку [125І]-тестостерону вкожній пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середні арифметичні значення швидкостей рахунку [125І]-тестостерону для кожної пари пробірок.
Відповідно до маркірування пробірок одержати значення розмірів Т, В - В5.
Розрахувати відношення Во/Т, у відсотках, де:
Во - середня швидкість рахункув пробірках, що містять пробу Co;
Т - загальна активність [125І]-тестостерону, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробах Т.
Значення Во/Тповинно бути не менше 30%.
Розрахувати розмір В/Во, у відсотках, для кожної каліброваної, контрольної і невідомої проби, де:
В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольні або невідомі зразки.
Побудувати калібрований графік залежності В/Во, у відсотках, від концентрації тестостерону в каліброваних пробах (нмоль. л) у координатах "logit-log".
За каліброваним графіком визначити вміст тестостерону в досліджуваних зразках сироватки крові.
Для переведення молярної концентрації в об'ємно-масову слід користуватися співвідношенням:
нмоль/л х 0,288 = нг/мл;
д) визначення прогестерону (РІА-ПРОГЕСТЕРОН-СТ)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, внести по 0,5 мл дистильованої води. Перемішати до повного розчинення препаратів, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Аналітичні пробірки помістити вштатив і кожну пару пробірок маркірувати позначенням того розміру, для виміру якої вони призначені:
Т - для визначення загальної активності [125І]-прогестерону в пробірці;
Вн - для визначення неспецифічного зв'язування;
Во - В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для пробірок із контрольною сироваткою [КС];
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл сироватки і внести в пробірки Во - В5. З флакона з контрольною сироваткою відібрати по 0,05 мл у пробірки Вкс. У пробірки Вх внести по 0,05 мл аналізованої сироватки крові пацієнтів.
У всі пробірки внести по 0,5 млрозчину [125І]-прогестерону. Вміст пробірок перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки при температурі 20-25 °С протягом 3 годин, при постійному струшуванні (не менше 300струшувань на хвилину).
З усіх пробірок, крім Т, цілком видалити вміст за допомогою водоструминного насосу.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти - швидкість рахунку [125І]-прогестерону вкожній пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [І 25І]-прогестерону для кожної пари пробірок.
Розрахувати співвідношення Вс/Т, у відсотках, де Т - загальна активність [125І]-прогестерону, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т; Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровану пробу Co. Значення Во/Т повинно бути не менше 25%.
Розрахувати співвідношення В/Во, у відсотках, для коленої пари пробірок каліброваних, контрольної і невідомих проб, де В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольну і невідомі проби.
У напівлогарифмічних координатах (вісь абсцис - логарифмічна, вісь ординат - лінійна) або координатах "logit-log" побудувати графік залежності В/Во, у відсотках (вісь ординат), від концентрації прогестерону (вісь абсцис) у каліброваних пробах.
Для невідомих і контрольної проб сироватки крові на підставі відповідних значень В/Во, у відсотках, за каліброваним графіком визначити зміст прогестерону.
Для переведення молярної концентрації прогестерону в масово-об'ємну слід користуватися співвідношенням: мкг/л (нг/мл) = нмоль/л х 0,314;
е) визначення прогестерону (РІА-ПРОГЕСТЕРОН-ПР)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакон із препаратом [125І]-прогестерону (якщо препарат ліофілізований) долити 11 мл дистильованої води і лишити на 10хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакона обережно перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакон із препаратоммоноклональних антитіл (якщо препарат ліофілізований) долити 10 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин, до повного розчинення таблетки.
Вміст флакона перемішати, уникаючи утворення піни.
Вміст флакона з моноклональнимиантитілами до прогестерону перенести у флакон із преципітуючим реагентом, старанно перемішати до утворення гомогенної суспензії.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, долити по 0,5 мл дистильованої води і залишити на 30 хвилин, до повного' розчинення таблеток. Перемішати, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах): Т - для визначення загальної активності [125І]-прогестерону, у пробірці; В - В5- для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для визначення концентрації прогестерону в контрольній сироватці;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл розчину і внести у відповідні аналітичні пробірки: В - С; В1 – С1; В2 – С2, Вз - Сз; В4 - С4; В5 - C5.
У пробірки Вкс внести по 0,05мл контрольної сироватки.
У пробірки Вх внести по 0,05 мланалізованої сироватки крові пацієнтів.
Примітка. При визначенні прогестерону у пацієнтів ізявно високим рівнем гормону (більш 100 нмоль/л) зразки аналізованої сироватки необхідно попередньо розвести сироваткою з низьким вмістом прогестерону, наприклад нормальною сироваткою крові чоловіків, у 10 разів. Рекомендується попередньо виміряти концентрацію прогестерону в сироватці, що використовується для розведення.
Вмістом прогестерону в сироватці-розріджувачі менше 2 нмоль/л можна зневажити.
У всі пробірки долити по 0,1 млрозчину [125І]-прогестерону.
Приготувати сумішмоноклональних антитіл до прогестерону з преципітуючим реагентом.
У всі пробірки, крім Т, внестипо 1,0 мл суміші преципітуючого реагенту із моноклональними антитілами допрогестерону.
Вміст пробірок старанно перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки протягом 2 годин при кімнатній температурі (18-25 °С).
Усі пробірки, крім Т, центрифугувати при кімнатній температурі (18-25 °С), у центрифузі з горизонтальним ротором, при прискоренні 1500-2000 g, протягом 20 хвилин.
Акуратно видалити над осадовурідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку- [123I]- прогестеронув кожній пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середні арифметичні значення швидкостей рахунку [125І]-прогестерону для кожної пари пробірок.
Відповідно до маркірування пробірок одержати значення розмірів Т, В - В5.
Розрахувати співвідношення Во/Т, у відсотках, де: Во - середня швидкість рахунку в пробірках, щомістять пробу "0 нмоль/л ";
Т - загальна активність [125І]-прогестерону, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т.
Значення Во/Тповинно бути не менше 30%.
Розрахувати розмір В/Во, у відсотках, для кожної каліброваної, контрольної і невідомої проби, де: В -середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольні або невідомі зразки.
Побудувати калібрований графік залежності В/Во, у відсотках, від концентрації прогестерону в каліброваних пробах (нмоль/л) у координатах "logit-log".
За каліброваним графіком визначити вміст прогестерону в досліджуваних зразках сироватки крові.
Для переведення молярної концентрації в об'ємно-масову слід користуватися співвідношенням:
нмоль/л хО,314 = нг/мл;
ж) визначення ест радіолу (РІА-ЕСТРАДІОЛ-СТ)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, внести по 0,5 мл дистильованої води. Перемішати до повного розчинення препаратів, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Аналітичні пробірки помістити вштатив і кожну пару пробірок маркірувати позначенням того розміру, для виміру якої вони призначені:
Т - для визначення загальної активності [125І]-ест радіолу в пробірці;
Во - В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для пробірок із контрольною сироваткою [КС];
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл сироватки і внести в пробірки Во -Вз. З флакона з контрольною сироваткою відібрати по 0,05 мл упробірки Вкс. У пробірки Вх внести по 0,05 мланалізованої сироватки крові пацієнтів.
У всі пробірки внести по 0,5 млрозчину [І 25І]-ест радіолу. Вміст пробірок перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки при температурі 20-25 °С протягом 3 годин, при постійному струшуванні (не менше 300струшувань на хвилину).
З усіх пробірок, крім Т, цілком видалити вміст за допомогою водоструминного насосу.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку [125І]-ест радіолу вкожній пробірці протягом 1 хвилини.
Не специфічність зв'язування дляцього набору не визначається.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-ест радіолудля кожної пари пробірок.
Розрахувати співвідношення В0/Т, у відсотках, де Т - загальна активність [125І]-ест радіолу. що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т; Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровану пробу Co. Значення Во/Т повинно бути не менше 30%.
Розрахувати співвідношення В/Во, у відсотках, для кожної пари пробірок каліброваних, контрольної і невідомих проб, де В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольну і невідомі проби.
У напівлогарифмічних координатах (вісь абсцис - логарифмічна, вісь ординат - лінійна) або координатах "logit-log" побудувати графік залежності В/Во, у відсотках (вісь ординат), від концентрації ест радіолу (вісь абсцис) у каліброваних пробах.
Для невідомих і контрольної проб сироватки крові на підставі відповідних значень В/Во, У відсотках, за каліброваним графіком визначити вміст ест радіолу.
Для перекладу молярної концентрації ест радіолу в масово-об'ємну слід користуватися співвідношенням:
мкг/л (нг/мл) = нмоль/л х 0,272;
з) визначення ест радіолу (РІА-ЕСТРАДЮЛ-ПР)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакон із препаратом [125І]-Е2(якщо препарат ліофілізований) долити 11 мл дистильованої води і залишити на 10хвилин, до повного розчинення таблетки. Вміст флакона обережно перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакон із препаратоманти сироватки до ест радіолу (якщо препарат ліофілізований) долити 10 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин до повного розчинення таблетки. Вміст флакона перемішати, уникаючи утворення піни.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, долити по 0,5 мл дистильованої води і залишити на 30 хвилин, до повного розчинення таблеток. Перемішати, уникаючи утворення піни.
Вміст флакона з розчиноманти сироватки до ест радіолу перенести у флакон із преципітуючим реагентом істаранно перемішати до утворення гомогенної суспензії.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах): Т - для визначення загальної активності [125І]-Е2, у пробірці; В - Вз - для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для визначення концентрації ест радіолу в контрольній сироватці;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл розчину і внести у відповідні аналітичні пробірки: В - С; В1 – С1; В2 – С2; Вз – C3, В4 -С4; В5 – C5.
У пробірки Вкс внести по 0,05мл контрольної сироватки.
У пробірки Вх внести по 0,05 мланалізованої сироватки крові пацієнтів.
Примітка. При визначенні ест радіолу в пацієнтів ізявно високим рівнем гормону (більш 10 нмоль/л, 2-3-й триместри вагітності) зразки аналізованої сироватки необхідно попередньо розвести сироваткою крові з низьким вмістом ест радіолу, наприклад нормальною сироваткою крові чоловіків, у 10 разів. Рекомендується попередньо виміряти концентрацію ест радіолу в сироватці, що використовується для розведення. Вмістом ест радіолу в сироватці-розріджувачі менше 0,2 нмоль/л можна зневажити.
У всі пробірки долити по 0,1 млрозчину [125І]-Е2.
Приготувати суміш анти сироватки до ест радіолу з преципітуючим реагентом.
У всі пробірки, крім Т, внестипо 1,0 мл суміші преципітуючого реагенту з анти сироваткою. Вміст пробірок старанно перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубувати всі пробірки протягом 2 годин, при кімнатній температурі (18-25 С).
Усі пробірки, крім Т, центрифугувати при кімнатній температурі (18-25 °С), у центрифузі з горизонтальним ротором, при прискоренні 1500-2000 g, протягом 20 хвилин.
Акуратно видалити над осадовурідину за допомогою водоструминного насосу, уникаючи захоплювання осаду.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і вимірити швидкість рахунку [125І]-Е2 укожній, пробірці протягом 1 хвилини.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середні арифметичні значення швидкостей рахунку [125І]-Е2 для кожної пари пробірок.
Відповідно до маркірування пробірок одержати значення розмірів Т, В - В5.
Розрахувати відношення Во/Т, у відсотках, де: Во - середня швидкість рахунку в пробірках, щомістять пробу "0 нмоль/л ";
Т - загальна активність [125І]-Е2, що вимірюється середньою швидкістю рахунку впробах Т.
Значення Во/Тповинно бути не менше 25%.
Розрахувати розмір В/Во, у відсотках, для кожної каліброваної, контрольної і невідомої проби, де: В -середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольні або невідомі зразки.
Побудувати калібрований графік залежності В/Во, у відсотках, від концентрації ест радіолу в каліброваних пробах (нмоль/л) у координатах "logit-log".
За каліброваним графіком визначити вміст ест радіолу в досліджуваних зразках сироватки крові.
Для переведення молярної концентрації в об'ємно-масову слід користуватися співвідношенням:
нмоль/л х 0,272 = нг/мл;
и) визначення пролактину (РІА-ПРОЛАКТИН-ПР)
Підготовка компонентів набору
У флакон із каліброваної пробив нести 2,0 мл дистильованої води. В інші флакони з каліброваними пробами внестипо 0,5 мл дистильованої води і залишити всі флакони на 10 хвилин при кімнатній температурі. Після розчинення акуратно перемішати, не допускаючи утворення піни.
У флакон із [125Т]-пролактин ом долити 11,0 мл дистильованої води. Перемішати до повного розчинення, уникаючи утворення піни.
У флакон із контрольною сироваткою внести 1,0 мл дистильованої води і залишити на 10 хвилин при кімнатній температурі. Старанно перемішати, уникаючи утворення піни.
Вміст флакона із системою поділу за 30 хвилин до використання старанно переміщати до., гомогенної однорідної суспензії і залишити при кімнатній температурі.
Проведення аналізу
Для проведення аналізу рекомендується таке маркірування пробірок (у дублікатах):
Т - для визначення загальної радіо активності;
В - для визначення зв'язуванняв нульовій точці каліброваної кривої;
В1-В5 - для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для пробірок із контрольними сироватками;
Вх - длявикористовуваних зразків;
Вн - для визначення неспецифічного зв'язування.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,1 мл сироватки і внести в ряд пробірок В0-В5. З флакона з контрольною сироваткою відібрати по 0,1 мл у пробірки, маркірованіВкс. У пробірки, призначені для аналізу невідомих зразків, внести по 0,1 мл аналізованої сироватки пацієнтів. У пробірки Вн, призначені длявизначення неспецифічного зв'язування, внести по 0,2 мл " нульової" каліброваної проби.
У всі пробірки внести по 0,1 млрозчину [125І]- пролактину.
У всі пробірки, крім Т і Вн, внести по 0,1 мл розчину анти сироватки, перемішати вміст усіх пробірок на вихровому змішувачі.
Усі пробірки інкубують при температурі 18-25 °С протягом 16-20 годин.
У всі пробірки, крім Т, внестипо 1,0 мл системи поділу і, старанно перемішавши вміст на приладі для струшування, інкубують при температурі 18-25 С протягом 1 години.
Усі пробірки, за винятком Т, центрифугувати при кімнатній температурі, при прискоренні 1500-2000 g, протягом 20 хвилин.
Над осадову рідину видалити за допомогою водоструминного насосу або декантируванням. Усі пробірки помістити в сцинтиляційний лічильник і виміряти швидкість рахунку [125І]-пролактину в кожній пробірці. Час рахування - 1 хвилина.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-пролактину для кожної пари пробірок.
Розрахувати відсоток неспецифічного зв'язування в системі, використовуючи формулу: Вн/Т=Вн/Т*100
Ця величина не повинна перевищувати 5%.
Розрахувати величину В/Во, у відсотках, для кожної пари пробірок каліброваних, контрольної і невідомих проб, де В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольні і невідомі проби (В1-В5; Вкс; Вх), Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровану пробу "0".
Розрахувати спроможність системи, що зв'язує:
В0/Т=В0/Т*100,
де Т - загальна активність [125І]-пролактину, що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т.
Відношення Во/Тповинно бути не нижче 30%.
У напівлогарифмічних координатах (вісь абсцис - логарифмічна, вісь ординат - лінійна) або logit-logкоординатах побудувати для каліброваних проб графік залежності В/Во, у відсотках (вісь ординат), від концентрації пролактину (вісь абсцис) у цихпробах. Для невідомих і контрольних проб сироватки крові на підставі відповідних значень В/Во, У відсотках, за каліброваним графіком визначити концентрацію пролактину. Концентрація пролактину в контрольній сироватці повинна відповідати зазначеній в паспорті і на етикетці флакона. За наявності комп'ютерного забезпечення для побудови каліброваної кривої і розрахунку концентрації гормону рекомендується використовувати сплайн-функцію або регресійний аналіз.
і) визначення кортизолу (РІА-КОРТИЗОЛ-СТ)
Підготовка компонентів набору
Перед використанням витримати компоненти набору при кімнатній температурі (18-25 °С) протягом 30-40 хвилин.
У флакони, що містять калібровані проби (якщо вони ліофілізовані) і контрольну сироватку, внести по 0,5 мл дистильованої води. Перемішати до повного розчинення препаратів, уникаючи утворення піни.
Проведення аналізу
Аналітичні пробірки помістити вштатив і кожну пару пробірок маркірувати позначенням того розміру, для виміру якої вони призначені:
Т - для визначення загальної активності [125I]-кортизолу впробірці;
Во - В5 -для побудови каліброваної кривої;
Вкс - для пробірок із контрольною сироваткою;
Вх - для досліджуваних зразків.
Відібрати з кожного флакона з каліброваними пробами по 0,05 мл сироватки і внести в пробірки Во -В5. З флакона з контрольною сироваткою відібрати по 0,05 мл упробірки Вкс. У пробірки Вх внести по 0,05 мланалізованої сироватки крові пацієнтів.
У всі пробірки внести по 0,5 млрозчину [125І]-кортизолу. Вміст пробірок перемішати на вихровому змішувачі.
Інкубують усі пробірки при температурі 20-25 С протягом 1 години, при постійному струшуванні (не менше 300струшувань на хвилину).
З усіх пробірок, крім Т, цілком видалити вміст за допомогою водоструминного насосу.
Усі пробірки помістити вгамма-лічильник і виміряти швидкість рахунку [125І]-кортизолу вкожній пробірці протягом 1 хвилини.
Не специфічність зв'язування дляцього набору не визначається.
Розрахунки і графічні побудови
Знайти середнє арифметичне значення швидкості рахунку [125І]-кортизолу для кожної пари пробірок.
Розрахувати співвідношення Во/Т, у відсотках, де Т - загальна активність [125І]-кортизолу. що вимірюється середньою швидкістю рахунку в пробірках Т; Во - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровану пробу Co. Значення Во/Т повинно бути не менше 50%.
Розрахувати співвідношення В/Во, у відсотках, для кожної пари пробірок каліброваних, контрольної і невідомих проб, де В - середня швидкість рахунку в пробірках, що містять калібровані, контрольну і невідомі проби.
У напівлогарифмічних координатах (вісь абсцис - логарифмічна, вісь ординат - лінійна) або координатах"logit-log" побудувати графік залежності В/Во, у відсотках (вісь ординат), від концентрації кортизолу (вісь абсцис) у каліброваних пробах.
Для невідомих і контрольної проб сироватки крові на підставі відповідних значень В/Во, у відсотках, за каліброваним графіком визначити вміст кортизолу.
Для перекладу молярної концентрації кортизолу в масово-об'ємну слід користуватися співвідношенням:
мкг/л (нг/мл) = нмоль/л х 0,362.
АНАЛІТИЧНІХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРУ
Специфічність аналізу. Перехресна реакція антитіл до статевого гормону (прогестерону) зі структурно-родинними стероїдами наведена в табл.2.
Таблиця 2
| Досліджувані речовини
| Перехресна реакція, %
|
| 1. Прогестерон
| 100
|
| 2. 17- альфа-оксипрогестерон
| 1,0
|
| 3. 5- альфа-прегнан-3,20 діон
| 9,6
|
| 4. Дигідроепіандростерон
| 0,09
|
| 5. Прегненолон
| 0,09
|
| 6. Тестостерон
| 0,001
|
| 7. Дезоксикортикостерон
| 0,32
|
| 8. Кортизол
| 0,001
|
| 9. Дезоксикортизол
| 0,02
|
Точність. Даний аналітичний параметр перевірявся тестом на " відкриття" статевого гормону (прогестерону), доданого дозразків сироватки крові, що містять різноманітні кількості ендогенногопрогестерону. Відсоток відкриття становив 90-110.
Лінійність. Різні розведення вихідних зразків були приготовлені шляхом розведення їх сироваткою крові, що не міститьпрогестерону). Залежність концентрації статевого гормону (прогестерону) відро зведення вихідної сироватки має лінійний характер.
Збіжність результатів аналізу. Коефіцієнт варіації для 10 визначень вмісту статевого гормону (прогестерону) в тому самому зразку сироватки крові з використанням набору РІА-ПРОГЕСТЕРОН-ПР не перевищував 8%.
Чутливість. Мінімальні концентрації статевих гормонів наведені у табл. З
Таблиця З
| | Найменування наборів
|
| Склад наборів
| Стерон Е3-125I
| PIO-ПЛ-125I
| РІА-тесто-стерон-СТ
| РІА-ТЕСТО-СТЕРОН-ПР
| РІА-ПРО-ГЕС-ТЕ-РОН-СТ
| РІА-ПРО-ГЕС-ТЕ-РОН-ПР
| РІА-ЕСТРА-ДІОЛ-СТ
| РІА-ЕСТРА-ДІОЛ-ПР
| РІА-ПРО-ЛАК-ТИН-ПР
| РІА-кор-ти-зол-СТ
|
| Чутливість,
| 1,5
| 3,0
| 0,2
| 0,5
| 0,3
| 0,5
| 0,03
| 0,05
| 2,9
| 10,0
|
| нмоль/л або нг/мл
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нмоль/
л
| нг/мл
| нмоль
/л
|
Клінічна перевірка набору. Концентрація статевого гормону (прогестерону) в сироватці крові становила:
чоловіка - 0,05-3,2 нмоль/л;
жінки - фолікулярна фаза - менше 5 нмоль/л;
лютеїнова фаза - 6-45нмоль/л; третій триместр вагітності - 30-300 нмоль/л. Источник
Рекомендується в кожній лабораторії при використанні набору реактивів для кількісного визначення гормонів статевої групи уточнити значення концентрацій гормонів статевої-групи, що відповідають нормальним.